Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Гуминовые вещества (ГВ) представляют собой полидисперсные биополимеры сложного строения с высокой молекулярной массой. В структуре ГВ выделяют центральную и периферическую части, первая из которых образована конденсированными и связанными углеводородными мостиками ароматическими и гетероароматическими кольцами с различными функциональными группами, вторая представлена алифатическими, полисахаридными и полипептидными цепями [2]. Перечисленные особенности строения гуминовых веществ определяют их химические, физико-химические и биологические свойства. Однако химическая структура и фракционный состав гуминовых веществ зависят от способа выделения, модификации и источника их получения [2, 8].

Учитывая особенности строения гуминовых веществ, определение их фрагментного состава для установления связи структуры ГВ с фармакологическим действием возможно только при использовании комплекса физико-химических методов анализа.

Элементный состав является одной из важнейших характеристик ГВ, с помощью которых проводится их идентификация. Сведения об элементном составе вещества позволяют получить значительную информацию об общих принципах построения молекул и некоторых их свойствах. С помощью этого метода можно судить не только о процентном содержании различных элементов, но и рассчитать такие параметры как атомные отношения и ненасыщенность [2, 6].

Спектроскопия в УФ и видимой области является ценным методом идентификации хромофорных функциональных групп для индивидуальных органических соединений. В случае сложных многокомпонентных объектов, к которым относятся гуминовые вещества, возможности данного метода ограничены, т.к. их спектры являются результатом перекрывания максимумов различных хромофоров и не позволяют получать информацию о групповом составе. Для характеристики ГВ принято использовать [2] величину коэффициента экстинкции и отношение оптических плотностей при 465 и 650 нм, так называемый коэффициент цветности (E4/E6).

Поскольку углерод является основным элементом гуминовых веществ, то для получения данных о типе углерода и его относительном содержании в различных структурных фрагментах широко используется 13С ЯМР спектроскопия. Основным преимуществом данного метода является получение количественной структурной информации без какой-либо предварительной пробоподготовки и химической модификации ГВ. Спектроскопия твердофазных образцов с кросс-поляризацией и вращением под магическим углом (CPMAS 13С ЯМР) является наиболее часто используемой техникой регистрации ЯМР спектров [5].

Целью данного исследования является комплексное изучение структурных особенностей ГВ, выделенных различными методами из озерного сапропеля.

Материалы и методы

В качестве объектов исследования использовали гуминовые вещества, выделенные из сапропеля озера Горчаково Тюкалинского района Омской области методом щелочного гидролиза с последующим осаждением при рН 1-2. Активированные гуминовые вещества (ГВА) получали по описанной ранее методике [4].

Элементный анализ ГВ и ГВА проводили методом пиролизной хроматографии на автоматическом CHNS/O элементном анализаторе «Vario Micro cube» Elementar GmbH, (Германия). Результаты элементного анализа были скорректированы исходя из зольности и влажности объектов. Вещества предварительно сушили в вакуум-эксикаторе над пентоксидом фосфора в течение суток. Влажность определяли по приросту массы образца после высушивания в результате выдерживания его на воздухе в течение 12 часов.

Спектры в УФ-видимой области регистрировали на спектрометре UNICO-2800 (США) в кварцевых кюветах с толщиной слоя 1 см в диапазоне от 190 до 900 нм. Отношения оптических плотностей при 465 и 650 нм (E4/E6) рассчитывали для 0,001% растворов гуминовых веществ, в качестве растворителя использовали 0,1М раствор натрия гидроксида.

Фрагментный состав ГВ и ГВА определяли методом спектроскопии ЯМР на спектрометре AVANCE III™ 400 (Bruker Analytic GmbH, Germany) с рабочей частотой на ядрах 13C 100,63 МГц. Спектры ЯМР13C регистрировали в твердой фазе в эксперименте с кросс-поляризацией и вращением под магическим углом (CPMAS 13С ЯМР). Навески соединений (100-200 мг) помещали в ротор из оксида циркония c внешним диаметром 4 мм и вращали со скоростью 10 кГц. Использовали импульсную последовательность RAMP CP (линейное увеличение амплитуды радиочастотного поля при переносе поляризации), время аквизиции (At) – 34 мс, задержку между импульсами (RD) – 5 с, число накоплений – 2000. Спад свободной индукции (ССИ) дополняли нулями до 4096 точек и проводили экспоненциальное умножение (70Гц). При фазовой коррекции фиксировали фактор первого порядка равным -45°. Шкалу выставляли по сигналу углерода карбоксильной группы глицина (176.1 м.д.).

Результаты и их обсуждение

Результаты элементного анализа и основные показатели для ГВ и ГВА представлены в таблице 1.

Таблица 1

Элементный состав и основные показатели для ГВ и ГВА

*В пересчете на беззольную сухую навеску (влажность 7%)

**Ненасыщенность U=C-H/2+N/2 [6]

Для характеристики изменений в строении ГВА, происходящих в процессе воздействия УФ света, особый интерес представляет степень окисленности, рассчитываемая как атомное соотношение О/С. Среднее соотношение O/C для ГВА составляет 0,55, для ГВ – 0,48, что косвенно указывает на увеличение количества кислородсодержащих групп в процессе щелочного фотолиза.

Также важным показателем является отношение H/C, характеризующее степень ароматичности или ненасыщенности (при низких значениях) или алифатичности (при высоких значениях). ГВ и ГВА имеют близкие значения данного отношения: 1,25 и 1,27 соответственно, что указывает на преобладание в их составе алифатических фрагментов (H/C>1) [2]. Более надежным показателем, коррелирующим с ароматичностью, является U – ненасыщенность, т.к. отношение H/C учитывает и присутствие кратных связей углерод – гетероатом в составе функциональных групп [6]. Рассчитанное значение U для ГВА указывает на снижение их ненасыщенности в процессе выделения под действием УФ света.

Анализируя содержание азота в исследуемых ГВ (4,87 масс. %) и ГВА (4,43 масс. %), можно отметить, что в целом они удовлетворяют требованиям диагностических признаков ГК по Д.С. Орлову [2], согласно которым содержание азота должно быть от 3 до 6 масс. %. Незначительное увеличение атомного отношения C/N в ГВА объясняется уменьшением количества углерода.

На рис. 1 представлены электронные спектры ГВ и ГВА в УФ и видимой областях. Спектры имеют характерный для гуминовых веществ вид. Спектр ГВА отличается от спектра ГВ максимумом при 265 нм и более сильным поглощением в диапазоне от 220 до 300 нм, что может свидетельствовать о присутствии большего количества полисопряженных фрагментов и/или об уменьшении доли периферической части в структуре ГВА. Полосы поглощения в данном диапазоне, вероятнее всего, соответствуют π→π* переходам полиенов, полиароматических фрагментов и их кислородсодержащих производных (К-полосы) [2].

Рис. 1. Электронные спектры поглощения ГВ и ГВА в УФ и видимой области

Представленные в таблице 2 значения и E4/E6 находятся в пределах, характерных для гуминовых кислот [2]. Ввиду того, что основной вклад в окраску данных соединений вносят сопряженные системы каркасной части с кислородсодержащими группами, а периферическая часть практически не окрашена, тогда данные характеристики позволяют оценить вклад негидролизуемой части в структуру молекулы ГВ и содержание в ней кислорода. Наблюдаемое снижение коэффициента цветности для ГВА может свидетельствовать об увеличении содержания полисопряженных фрагментов и увеличении степени их окисленности по сравнению с ГВ. Сравнение коэффициентов экстинкции также подтверждает данное заключение.

Таблица 2

Спектроскопические коэффициенты для ГВ и ГВА

Таким образом, вид спектральных линий и, как следствие, коэффициенты позволяют оценивать изменения в структуре гуминовых веществ, происходящие при облучении их УФ светом и согласуются с данными элементного анализа.

Вследствие низкого содержания природного изотопа углерода 13С получение количественных спектров с хорошим соотношением сигнал-шум в растворе требует значительно большего приборного времени, чем в случае твердой фазы. По этой причине нами был выбран метод твердофазной спектроскопии с кросс-поляризацией и вращением под магическим углом (CPMAS 13С ЯМР). Для регистрации количественных спектров использовали рекомендации, предложенные в работе [5].

Полученные спектры были проинтегрированы по девяти примерным интервалам (м.д.): 48–5 (алкильные фрагменты); 58–48 (метоксильные (–OCH3) группы); 64–58 (O- и N-метилензамещенные (CH2–O,N) фрагменты); 90–64 (O- и N-метинзамещенные (CH–O,N) фрагменты, преимущественно в полисахаридах); 108–90 (аномерный углерод в полисахаридах); 145–108 (углерод незамещенных и алкилзамещенных ароматических фрагментов); 165–145 (углерод фенолов, ароматических эфиров или аминов); 187–165 (углерод карбоксильных групп и их производных); 220–187 (карбонильный углерод в альдегидах и кетонах) [1]. CPMAS 13С ЯМР спектры ГВ и ГВА представлены на рис. 2.

Рис. 2. CPMAS 13С ЯМР спектры ГВ и ГВА

В целом спектры ГВ и ГВА имеют схожий вид. Основные различия проявляются в алкильном регионе (48-5 м.д.): в процессе активации увеличилось относительное содержание метильных (CH3-C(O)-O-, CH3-CH=CH-) и метиленовых групп в α- и β-положении к амино- или карбоксигруппе (42.1 м.д.) [8]. Также снизилась интенсивность сигналов углерода полисахаридных фрагментов в области 60, 70 и 100 м.д. Данные по количественному содержанию углерода в структурных фрагментах представлены в таблице 3.

Таблица 3

Распределение углерода по структурным фрагментам в ГВ и ГВА по данным

CPMAS 13С ЯМР спектроскопии

*Степень ароматичности CAr/CAlk=(CAr+ CArO)/(CHn+CCarb) [1]

**Содержание полисахаридных фрагментов CCarb=CH2O+OCH+OCO [1]

Анализ фрагментного состава показывает, что ГВ и ГВА отличаются низким содержанием ароматического углерода и высоким содержанием углерода алифатических цепей и, как следствие, низкой степенью ароматичности (0,26%), которая характеризует соотношение ароматических и алифатических фрагментов. Необходимо отметить, что под действием УФ света, в ГВА происходит снижение доли углерода в составе полисахаридов (на 19 %) по сравнению с ГВ. Полученные результаты согласуются с данными ИК-спектроскопии [3]. Также в результате активации происходит увеличение количества кислородсодержащих фенольных (на 7 %), карбоксильных (на 17 %) и карбонильных групп (в 4 раза), что согласуется с данными элементного анализа.

Ввиду известной проблемы, связанной с регистрацией количественных спектров [7], нами была выполнена проверка полученных результатов в сравнении с данными элементного анализа. Проверку выполняли по методике, предложенной в работе [1]. Вычисленные по результатам ЯМР спектроскопии атомные отношения H/C по формуле

составили для ГВ и ГВА 1,37, что на 8% выше результатов элементного анализа (таблица 1). Таким образом, выполненные расчеты показали, что выбранные условия регистрации CPMAS 13С ЯМР спектров позволяют получать количественную информацию о структуре ГВ.

Заключение

Методами элементного анализа, спектроскопии в УФ и видимой области и CPMAS 13С ЯМР показано, что в процессе щелочного фотолиза гуминовые вещества претерпевают структурные изменения.

В активированных гуминовых веществах увеличивается степень окисленности, растет содержание кислородсодержащих групп (карбоксильных, карбонильных и фенольных), уменьшается количество полисахаридных фрагментов, а также снижается коэффициент цветности и ненасыщенность ГВА.

В целом, гуминовые вещества сапропеля, согласно полученным данным, характеризуются низкой степенью ароматичности и высоким содержанием алифатических цепей.

Рецензенты:

Гришин А.В., д.фарм.н., профессор, заведующий кафедрой фармации ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Омск.

Огай М.А., д.фарм.н., доцент кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Омск.