Введение
Производственные питательные среды чаще всего готовят на основе белковых гидролизатов. Гидролиз белков представляет собой технологический процесс расщепления протеина с образование азотистых соединений, легко усвояемых микробной клеткой.
Несмотря на то что белковые гидролизаты получили широкое распространение, работы по изысканию нового сырья, а также изучению оптимальных методов гидролиза белков по-прежнему актуальны [1] .
Чаще всего для приготовления питательных сред используются гидролизаты из мяса. В настоящее время, в связи со сложной экологической обстановкой и антропогенным воздействием на окружающую среду, мясное сырье содержит антибиотики, химикаты, нитраты, токсические продукты, что отрицательно отражается на культивировании промышленных штаммов [2], а также является дорогостоящим [7].
Высокая пищевая и биологическая ценность вермикультуры калифорнийских червей предоставляют широкие возможности для ее использования в различных отраслях промышленности. Белок, полученный из червей, используется в качестве основного компонента при производстве кормов для животных, а также в рационе питания человека. В Китае вермикультуру используют для приготовления БАВ [3; 6].
Важную роль в оценке биомассы калифорнийских червей (Eisenia fetida) играет его биохимический состав. В теле червя содержится 67-72% белка, 7-19% жиров, 18-20 углеводов, 2-3% минеральных веществ, полный набор аминокислот [8; 10]. Кроме того, красный червь пригоден для домашнего и промышленного разведения.
Несмотря на высокий биологический потенциал биомассы калифорнийских червей, нами предприняты дополнительные попытки его повышения с помощью ряда манипуляций.
Известным технологическим приемом, который способен максимально обеспечить усиление эффективности и полноценности, предлагаемых субстратов является методика получения тканевых препаратов по В.П. Филатову (1955) [9]. В основе данной методики лежит учение о биогенных стимуляторах, которые возникают в организме в результате воздействия на него неблагоприятных для жизни факторов среды. Некоторые авторы к этим веществам относят, прежде всего, низкомолекулярные пептиды [5].
Сочетание этих принципов (лазерная активация и метод получения тканевых препаратов по Филатову), а также использование собственных модификаций этого метода положено в основу отработки технологии повышения биологической активности сырьевых объектов, используемых нами, и направлено именно на сохранение и увеличение концентрации большинства биологических компонентов вермикультуры калифорнийских червей, в соответствии с питательными и другими физиологическими потребностями большинства микроорганизмов (дыхание, размножение, рост).
В процессе работы весь технологический процесс получения гидролизатов из вермикультуры калифорнийских червей включал в себя 4 этапа: выращивание в экологически чистых условиях; отбор, очищение биомассы от частиц гумуса, активацию и гидролиз.
Первый этап подготовительной стадии заключался в выращивании калифорнийских червей в лабораторных условиях. За один месяц от тридцати особей калифорнийских червей примерно получили порядка 3500 экземпляров.
На втором этапе биомассу калифорнийских червей отбирали из субстрата живыми и очищали от частиц гумуса.
На третьем этапе проводили активацию биомассы калифорнийских червей с учетом предложенных выше принципов.
На четвертом этапе проводили гидролиз.
Выбранные нами модификации путей активации субстрата получаемого из биомассы калифорнийских червей заключались в поочередном воздействии на живое сырье полупроводниковым низкочастотным лазерным аппаратом АЛ-01 «Семикон» с интервалом в одни сутки и помещением их в холодильную камеру при температуре плюс 4...8°С после каждого сеанса облучения.
В процессе эксперимента всех калифорнийских червей, после отбора и очищения от частиц гумуса, делили на две группы по 300 штук. Червей первой группы не подвергали лазерному облучению, а лишь закладывали в холодильную камеру на трое суток. Червей второй группы подвергали лазерному облучению по указанной выше методике на расстоянии до 1 см.
После первого этапа облучения (в течение часа) отмечены существенные микроструктурные изменения, свидетельствующие об активации тканей червя. В кожно-мускульном мешке червей наблюдается гиперемия и увеличение количества клеток-макрофагов, при этом многие из них с крупными ядрами.
В то же время в группе червей, которые не подвергались облучению, на этом этапе существенных структурных изменений по сравнению с морфологией червей до начала эксперимента не обнаружено.
Гистологические исследования после вторичного лазерного облучения (на вторые сутки) свидетельствуют, что у червей, подвергнутых облучению, еще сохраняется умеренная макрофагальная реакция. Присутствуют также признаки гиперемии, выраженные, однако, несколько ниже, чем после первого облучения.
Вышеупомянутые факты свидетельствуют о том, что применение лазерного облучения для вермикультуры, вызывает морфологические изменения, свидетельствующие о его стимулирующем влиянии на кровоснабжение тканей и иммунную систему червя, в частности на лимфоцитоподобные амебоциты. По нашему мнению, это связано со стимулирующим эффектом на обменные процессы в тканях.
Через трое суток после начала эксперимента в обеих экспериментальных группах отмечено выраженное снижение активности червей по сравнению с предыдущими сутками. На этом этапе в обеих группах черви не проявляли двигательной активности. Поэтому несмотря на некоторые гистологические различия, четвертое облучение сочли нецелесообразным.
В целом, полученные результаты свидетельствуют о высоком активирующем воздействии лазера на первых этапах облучения, а также о высокой степени целесообразности использования низкочастотного облучения лазером АЛ-01 «Семикон» вермиультуры с целью ее активации.
После активации вермикультуры калифорнийских червей переходили к основному этапу - технологии приготовления гидролизата. Основой для получения ферментативного гидролизата явились рекомендации, изложенные Ю.А. Козловым (1950) [4] .
Сущность приготовления ферментативного гидролизата из калифорнийских червей заключалась в следующем. Биомассу калифорнийских червей в количестве 0,5 кг соединяли с 1 л водопроводной водой и кипятили в течение 10 мин. Затем червей отделяли от бульона и измельчали в гомогенизаторе до однородной массы. Бульон охлаждали до температуры 45-50ºС, подщелачивали Na2CO3 до pH 8,2 по фенолфталеину. Фарш калифорнийских червей помещали в трехлитровый стеклянный баллон, заливали готовым остывшим бульоном, добавляли 150 г поджелудочной железы крупного рогатого скота. К общему объему содержимого баллона вливали 2 % хлороформа, закрывали плотно ватно-марлевым тампоном с пергаментом. Баллон помещали в термокамеру при температуре 37ºС. Выдерживали в течение 14 суток, встряхивали в течение первых суток через каждые 15 минут по 5 минут, а в последующие дни через каждые два часа по 5 минут. Со вторых суток измеряли уровень аминного азота: 446 мг%; 549 мг%; 653 мг%; 661 мг%; 675 мг%; 681 мг%; 697 мг%; 727 мг%; 749 мг%; 766 мг%; 781 мг%; 786 мг%; 786 мг%; 786 мг%. В конце переваривания жидкость фильтровали через ткань Бельтинга и 4 слоя фильтровальной бумаги. Измеряли аминный азот. В фильтрат добавляли 2 % хлороформа, пробковали и хранили при температуре от 2 до 8ºС. Гидролизат представлял собой жидкость коньячного цвета.
Для оценки эффективности использования полученного гидролизата проводили микробиологический контроль. В качестве тест-штаммов выбрали S. flexneri 1а 8516; S. typhi H-901; S. faecalis-602; Y. pestis Ev; P. aeruginosa 27/99; S. marcescens-1; Lactobacterium-сп; E. coli CA-18. Параллельно производили контрольные высевы на агар Хоттинера. На новой питательной среде, по сравнению с агаром Хоттингера, культуральные и морфологические свойства этих микроорганизмов были более выраженными.
Подобные свидетельствуют о том, что новые питательные среды по химическому составу вполне обеспечивают физиологические потребности вышеуказанных микроорганизмов, что обусловливает их универсальность.
Рецензенты:
Хе В.Х., д.б.н., доцент, проректор по научной работе ННОУ ВПО «Институт Дружбы народов Кавказа» Министерства образования и науки РФ, г. Ставрополь.
Мишвелов Е.Г., д.б.н., профессор, профессор кафедры экологии и природопользования Института математики и естественных наук ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский федеральный университет», г. Ставрополь.