Введение
Разработка эффективных антисептиков с целью снижения риска гнойно-септических осложнений в хирургии продолжает оставаться одной из важнейших проблем в современной медицине [2; 4; 6]. По данным литературы, в настоящее время пациенты с гнойными осложнениями составляют от 40% [1] до 49% больных хирургического профиля [3]. Особый интерес представляет создание антисептиков для использования при дезинфекции поверхностей, которые найдут широкое применение в различных лечебных учреждениях, а также детских образовательных учреждениях в связи со снижением трудозатрат на частую обработку поверхностей и увеличением эффективности их микробицидного действия.
В современной медицине наносеребро находит весьма разнообразное применение: лечение ран, дезинфекция поверхностей, покрытие имплантов. Сохраняющийся интерес к совершенствованию способов получения наночастиц серебра объясняется несовершенством существующих технологий и попытками улучшения таких свойств получаемого продукта, как стабильность и биоактивность, а также поиском путей для снижения производственных затрат.
Используемые лекарственные средства системного действия - антибиотики широкого спектра действия - в настоящее время зачастую оказываются неэффективными в связи с развитием к ним резистентности у микроорганизмов из-за нерациональной неконтролируемой фармакотерапии. Так, высокоэффективный несколько десятилетий назад пенициллин в современной медицине практически не применяется в связи с развитием резистентности у большинства имеющих клиническое значение штаммов микроорганизмов. Широкая аллергизация населения (по данным различных авторов, от 48 до 72%), в том числе к лекарственным антибактериальных средствам, а также тяжелые осложнения от применения таких препаратов (аминогликозиды вызывают нефротоксический эффект вплоть до почечной недостаточности, требующей проведения гемодиализа; карбапенемы могут приводить к некорригируемой иммуносупрессии) создают угрозу для здоровья и жизни при их применении.
Отдельного внимания заслуживает то, что в последние годы отмечается отчетливый рост заболеваемости госпитальными инфекциями, возбудителями которых являются неферментирующие грамотрицательные бактерии (НГОБ). Ведущее место в этиологической структуре этих инфекций занимают P. aeruginosa и Acinetobacter [7]. Лечение ВБИ, вызванных этими возбудителями, осложнено исходно высоким уровнем устойчивости микроорганизмов к традиционным антибактериальным препаратам, что актуализирует проблему создания новых терапевтических средств.
Антибактериальная активность серебра известна давно. Современная фармацевтическая промышленность предлагает целый ряд серебросодержащих препаратов: растворы нитратов серебра, коллоидные взвеси протеинатов серебра, металл-белковые композиции [8]. Но их применение ограничивается тем, что оказываемое ими цитотоксическое действие распространяется не только на микробные клетки, но и на клетки макроорганизма.
Сложившаяся обстановка побуждает исследователей к поиску новых эффективных средств с антимикробной активностью. Одним из таких агентов является серебро, которое получило «вторую жизнь» в качестве нанопрепарата антисептического назначения [9]. В этом плане перспективным представляется использование наноструктурированных препаратов серебра, так как они эффективны при значительно более низких концентрациях частиц металла.
Цель работы
Исследование противомикробной активности коллоидных растворов наносеребра, полученных путем диффузионно-кавитационного фотохимического восстановления, по отношению к клиническим штаммам P. aeruginosa и Acinetobacter.
Материалы и методы
В качестве тест-штаммов работе использованы 10 клинических изолятов P. aeruginosa и Acinetobacter (по 5 штаммов каждого микроорганизма). Идентификацию выделенных культур проводили бактериологическим методом с использованием автоматического анализатора VITEK.
Для получения оригинального коллоидного наносеребра нами использовалась авторская технология кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления раствора серебра, то есть комплексное одновременное воздействие на реакционную систему ряда физических факторов (ультрафиолетового излучения, ультразвука, равномерного перемешивания) с определенными оптимальными параметрами, что позволяет получить синергетический эффект физических факторов при синтезе препарата серебра с наночастицами. Технология приготовления нанопрепаратов серебра путем кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления заключается в том, что к 1%-ному раствору AgNO3 добавляют 5%-ный раствор NaOH в объемном соотношении 5:1, образовавшийся осадок Ag2O пятикратно отмывают бидистиллированной водой. Параллельно готовят навеску лиганда и растворяют его в бидистиллированной воде до получения 1%-ного раствора (полное растворение лиганда в растворе). Соотношение AgNO3 и лиганда по массе сухого вещества должно составлять 1:3. В полученную взвесь Ag2O в бидистиллированной воде вносят 1%-ный раствор лиганда при интенсивном перемешивании. После образования однородного раствора доводят объем раствора бидистиллированной водой до получения 0,0059 М раствора серебра и далее проводят фотохимическое восстановление этого раствора в течение 60 мин под действием ультрафиолетового облучения и ультразвуковых волн. В качестве лиганда нами использовался спиртовой экстракт хлорофилла, который получали при соотношении сырья с экстрагентом 1:3.
Выполнение синтеза наносеребра с использованием предложенной технологии позволяет: получить более гомогенную систему по размеру наночастиц серебра и уменьшить размеры самих наночастиц серебра до 10-15 нм в готовом образце; безопасно и широко использовать полученные растворы с наночастицами серебра; сократить время инкубации при сохранении высокой производительности системы, что ведет к снижению стоимости получаемого препарата с наночастицами серебра при сохраняющейся эффективности его действия на микроорганизмы.
Для исследования использовались несколько образцов препарата с разной концентрацией серебра: 100 мкг/мл; 50 мкг/мл; 10 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы нитрата серебра и лиганда (спиртовой экстракт хлорофилла, который получали при соотношении сырья с экстрагентом 1:3) в одинаковых концентрациях. Для определения минимальной эффективной концентрации наносеребра в препарате изучали его противомикробное действие в концентрации 10 мкг/мл; 8 мкг/мл; 5 мкг/мл; 3 мкг/мл; 1 мкг/мл.
Чувствительность клинических изолятов P. aeruginosa и Acinetobacter к препарату определяли методом серийных разведений в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Результаты учитывали после 18-20-часового культивирования в термостате при 37 °С. Контрольные высевы из разведений с отсутствием видимого роста бактерий осуществляли на среду АГВ.
Питательную среду АГВ готовили из сухой среды промышленного производства в соответствии с инструкцией изготовителя и автоклавировали 20 минут при 121 °С.
Результаты и обсуждения
Установлено, что нитрат серебра в концентрации 10 и 1 мкг/мл не обладает антимикробной активностью по отношению к исследуемым клиническим штаммам P. aeruginosa и Acinetobacter: все тест-культуры давали видимый рост в жидкой питательной среде с препаратом (табл. 1). При концентрации нитрата серебра 50 мкг/мл видимый рост в жидкой питательной среде отсутствовал, однако контрольные посевы были положительны (табл. 2). Полностью подавлял рост индикаторных штаммов нитрат серебра только в концентрации 100 мкг/мл. В этом разведении не регистрировалось видимого роста культур микроорганизмов, контрольные посевы также были отрицательны (табл. 2).
Таблица 1.
Сравнительный анализ антимикробной активности препарата наносеребра, нитрата серебра и лиганда
|
Штаммы |
Концентрация препарата, мкг\мл |
|||||||||||
|
Нитрат серебра |
Лиганд |
Коллоид |
||||||||||
|
100 |
50 |
10 |
1 |
100 |
50 |
10 |
1 |
100 |
50 |
10 |
1 |
|
|
P. aeruginosa |
0 |
0 |
5 |
5 |
0 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Acinetobacter |
0 |
0 |
5 |
5 |
0 |
0 |
0 |
5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Лиганд совершенно не обладал антимикробными свойствами в концентрации 1 мкг/мл: все тест-культуры давали видимый рост в жидкой питательной среде с препаратом (табл. 1). В концентрациях 50 и 10 мкг/мл лиганд проявлял бактериостатическую активность: в жидкой питательной среде регистрировалось отсутствие видимого невооруженным глазом роста, но контрольные посевы этого материала давали положительные результаты (табл. 2). Бактерицидным действием лиганд обладал в концентрации 100 мкг/мл: не наблюдалось признаков роста микроорганизмов как в жидкой питательной среде (табл. 1), так и на АГВ при контрольных посевах последней (табл. 2).
Таблица 2.
Количество положительных контрольных посевов
|
Штаммы |
Концентрация препарата, мкг\мл |
|||||||||||
|
Нитрат серебра |
Лиганд |
Коллоид |
||||||||||
|
100 |
50 |
10 |
1 |
100 |
50 |
10 |
1 |
100 |
50 |
10 |
1 |
|
|
P. aeruginosa |
0 |
5 |
5 |
5 |
0 |
5 |
5 |
5 |
0 |
0 |
3 |
5 |
|
Acinetobacter |
0 |
5 |
5 |
5 |
0 |
5 |
5 |
5 |
0 |
0 |
2 |
5 |
Коллоидный раствор наносеребра обладал антимикробной активностью во всех исследованных концентрациях (табл. 1): в соответствующих разведениях видимый рост бактерий отсутствовал. В то же время в концентрации 1 мкг/мл коллоидный раствор наносеребра обладал только бактериостатической активностью (контрольные посевы из этого разведения были положительны у всех 10 штаммов). В концентрации 10 мкг/мл коллоидный раствор наносеребра обнаружил бактериостатические свойства в отношении 3 штаммов P. aeruginosa и 2 штаммов Acinetobacter. На остальные тест-культуры эта концентрация препарата действовала бактерицидно (табл. 2).
В экспериментах по определению минимальной бактериостатической подавляющей концентрации наносеребра в препарате установлено её значение на уровне 3 мкг/мл.
На основании вышеизложенного можно заключить, что антимикробная активность по отношению к неферментирующим грамотрицательным бактериям в ряду препаратов: коллоидный раствор наносеребра, лиганд, нитрат серебра - убывает. А наиболее результативным является использование коллоидного раствора наносеребра.
Выводы
1. Полученный препарат коллоидного раствора наносеребра обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении P. aeruginosa и Acinetobacter.
2. Эффективность противомикробного действия препарата наносеребра превышает таковую исходного нитрата серебра и лиганда (промежуточной стадии синтеза).
3. Полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности создания лекарственной формы коллоидного наносеребра с антимикробной активностью по отношению к P. aeruginosa и Acinetobacter на основе способа диффузионно-кавитационного фотохимического восстановления серебра.
Рецензенты:Павленко С.Г., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой хирургических болезней, Негосударственное общеобразовательное частное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский медицинский институт», г. Краснодар.
Быков И.М., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой фундаментальной и клинической биохимии, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар.