Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Нейтрофильные гранулоциты - наиболее мобильная и многочисленная популяция лейкоцитов. В течение суток в костном мозге человека образуется до 10¹¹ зрелых нейтрофилов, средний период полувыведения которых из циркуляции составляет 6-8 часов. До недавнего времени считалось, что основной функцией нейтрофилов является антимикробная защита, осуществляемая, прежде всего, за счет фагоцитоза, т.е. способности поглощать микроорганизмы и умерщвлять их с помощью микробоцидных веществ, содержащихся в гранулах. В число этих соединений входят миелопероксидаза, лактоферрин, антимикробные катионные пептиды (дефенсины, кателицидины) и другие [2].

Известны три основных типа гранул нейтрофилов - азурофильные, специфические и желатиназные, которые различаются по времени формирования при миелопоэзе и по составу своего содержимого [2]. Маркерными белками для специфических гранул являются лактоферрин, кателицидины, B₁₂-связывающий белок, для азурофильных - миелопероксидаза, дефенсины, катепсины, эластаза. Общим белком для всех типов гранул является лизоцим. Кроме разницы в содержимом, гранулы различаются по степени и последовательности их участия в экзоцитозе (дегрануляции) в ответ на различные стимулы. Установлено, что в первую очередь выделяют свое содержимое во внеклеточную среду  желатиназные гранулы, затем - специфические и в последнюю очередь - азурофильные [10].

Необходимо отметить, что секреция содержимого гранул происходит не только во время фагоцитоза в местах воспаления. В плазме крови в норме всегда присутствуют гранулярные белки и пептиды, количество которых может меняться как при физиологических состояниях, так и при некоторых заболеваниях. С точки зрения клиницистов, эти белки и пептиды прежде всего - маркеры функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов, которые рассматриваются в качестве ведущих клеточных факторов врожденного иммунитета, а также как универсальные звенья гомеостаза, реагирующие на многочисленные сигналы о нарушении постоянства внутренней среды [1]. В то же время накапливается все больше данных о том, что белки и пептиды нейтрофилов обладают не только микробоцидными свойствами, но и влияют на регуляцию других функций организма, имеющих отношение к воспалению, врожденному и адаптивному иммунитету и стрессу [9].

Например, установлено, что лактоферрин может связывать в циркуляции компоненты бактериальных клеток (ЛПС) или их рецепторов и тем самым предотвращать развитие воспаления и связанное с ним повреждение тканей, подавлять высвобождение провоспалительных цитокинов и активных форм кислорода [5]. Показано, что лактоферрин транспортируется в ядро, где он может связываться с ДНК и активировать экспрессию отдельных групп генов [6].

Миелопероксидаза непосредственно вовлечена в метаболизм активных форм кислорода, высокий уровень содержания этого фермента в тканях может способствовать образованию хлораминов, которые, являясь своеобразными сигнальными молекулами (аларминами), способны влиять на генерацию макрофагами медиаторов воспаления [7].

Антимикробные пептиды (дефенсины, кателицидины) влияют на клетки врожденного иммунитета (нейтрофилы, моноциты, дендритные клетки) и эпителиальные клетки, определяя отдельные стороны взаимодействия врожденной и адаптивной иммунной систем. Для млекопитающих была показана роль АМП в реализации таких клеточных функций, как хемотаксис, апоптоз, генная транскрипция и продукция цитокинов [8].

В связи с этим можно предположить, что иммуномодулирующие свойства некоторых препаратов, в частности «Глутоксима», могут быть связаны с их способностью вызывать дегрануляцию нейтрофильных гранулоцитов, приводящей к высвобождению эндогенных иммунорегуляторов.

Целью нашей работы явилось изучение действия «Глутоксима» на дегрануляцию нейтрофильных гранулоцитов, как изолированных, так и в составе цельной крови в сравнении с другими известными стимуляторами дегрануляции - липополисахаридом и N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином.

Методы

Реактивы

Глутоксим ®-РСО, Серия 03102011 - производитель и поставщик ЗАО «ФАРМА ВАМ». Липополисахарид E.coli 055:В5 (ЛПС), N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (fMLP), пентоксифиллин (РХ), Histopaque 1119 и Percoll получены от компании Sigma.

Питательная среда RPMI-1640 с L-глутамином - производство компании «БиолоТ».

Сыворотка крови плодов коровы - производство компании «БиолоТ».

Забуференный физиологический раствор (ЗФР) -  Na-фосфатный буфер 0,01 М, рН=7,5, содержащий 0,137 M NaCl и 0,0027 M KCl.

Объект исследования

В работе использовали венозную кровь, полученную от практически здоровых добровольцев. Забор осуществляли стерильным шприцем, затем помещали в стерильную пластиковую пробирку, содержащую 5%-ный раствор натриевой соли ЭДТА (рН 7,3) в качестве антикоагулянта из расчета 0,4 мл раствора ЭДТА на 12 мл крови.

Стимулирование изолированных нейтрофильных гранулоцитов

Для выделения нейтрофильных гранулоцитов из цельной крови использовали два последовательных разделения с помощью центрифугирования в различных градиентах плотности - Histopaque и Percoll [3].

На первом этапе на 6 мл раствора Histopaque 1119 наслаивали 6 мл крови, центрифугировали 30 минут при 800 g, отбирали нижнюю розоватую фазу, содержащую гранулоциты, промывали забуференным физраствором (ЗФР), ресуспендировали в ЗФР и наносили на градиент Percoll - 85, 80, 75, 70 и 65%. Центрифугировали 30 минут при 800 g и отбирали фазу, содержащую гранулоциты.

Клетки промывали в ЗФР, ресуспендировали в среде RPMI, содержащей 5%-ную эмбриональную сыворотку, подсчитывали количество клеток в камере Горяева.

Выделенные нейтрофильные гранулоциты, ресуспендированные в среде RPMI, содержащей 5%-ную эмбриональную сыворотку, вносили в лунки 96 луночных планшетов (1 млн на лунку) и инкубировали в СО₂-инкубаторе в течение часа при температуре 37 °С, чтобы дать нейтрофилам прикрепиться к пластику. Через час среду удаляли, в лунки с прикрепившимися клетками добавляли по 0,2 мл свежей среды и по 0,01 мл стимуляторов в ЗФР, по три лунки на каждый вариант стимулятора. Планшеты инкубировали при 37 °С в течение 15 или 30 минут, затем отбирали культуральную жидкость, замораживали и до анализа хранили при -20 °С.  

В качестве стимуляторов использовали: 1) глутоксим - конечные концентрации 100 мкг/мл, 10 мкг/мл и 1 мкг/мл; 2) ЛПС - конечная концентрация 1 мкг/мл; 3) fMLP - конечная концентрация 0,5 мкг/мл; 4) контроль - ЗФР.

Стимулирование клеток цельной крови

Кровь с антикоагулянтом разливали в стерильные эппендорфы и добавляли стимуляторы в объеме 1/100 объема крови. Пробирки инкубировали при 37 °С в течение 15 или 30 минут, затем центрифугировали при 400 g в течение 3 минут, отбирали плазму, замораживали ее и до анализа хранили при -20 °С.  

В качестве стимуляторов использовали: 1) глутоксим - конечные концентрации 100 мкг/мл, 10 мкг/мл и 1 мкг/мл; 2) ЛПС - конечная концентрация 1 мкг/мл; 3) fMLP - конечная концентрация 0,5 мкг/мл; 4) пентоксифиллин (РХ) - конечная концентрация 0,56 мг/мл; 5) контроль - ЗФР.

Количественное определение белков и пептидов нейтрофилов

Количественное определение белков и пептидов нейтрофилов в плазме и культуральной жидкости проводили с использованием наборов фирмы Hycult biotech (Нидерланды) для иммуноферментного определения миелопероксидазы (МПО) (кат. номер НК324), лактоферрина (кат. номер НК329) и альфа-дефенсинов 1-3 (кат. номер НК317).

Процедуру определения концентраций осуществляли в соответствии с инструкцией производителя.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Достоверность различий между группами оценивали по U-критерию Манна-Уитни, за достоверный принимали 95%-ный уровень значимости (р<0,05).

Результаты и обсуждение

В ходе экспериментов установлено, что «Глутоксим», так же как и fMLP, слабо влияет на секрецию содержимого специфических гранул изолированных нейтрофильных гранулоцитов. Секреция лактоферрина наблюдается только после 30-минутной инкубации с ЛПС и «Глутоксимом» в высокой концентрации (100 мкг/мл). Секреция содержимого азурофильных гранул под действием «Глутоксима» осуществляется с большей интенсивностью, чем специфических и в широком спектре концентраций стимулятора. Установлено, что имеет место достоверное повышение содержания дефенсинов и МПО в культуральной жидкости изолированных нейтрофилов после 30-минутной инкубации с «Глутоксимом» по сравнению с контролем. Причем инкубация с ЛПС не влияла на секрецию дефенсинов (табл. 1). Инкубация в течение 15 минут не приводила к изменению концентрации нейтрофильных белков и пептидов в культуральной жидкости.

Таблица 1. Содержание лактоферрина, МПО и дефенсинов в инкубационной жидкости культуры нейтрофилов после 30-минутной инкубации со стимуляторами.

* - p<0,05 по сравнению с контролем.

Исследование секреции содержимого гранул нейтрофильных гранулоцитов в цельной крови (ex vivo) показало другую динамику дегрануляции. Секреция лактоферрина происходит под действием всех исследованных стимуляторов. Причем при стимуляции «Глутоксимом» и ЛПС концентрация белка в плазме после 15-минутной инкубации была выше, чем после 30-минутной. Для fMLP такой зависимости не наблюдалось (табл. 2).

«Глутоксим» вызывает секрецию дефенсинов из нейтрофилов в цельной крови при всех испытуемых концентрациях, причем концентрация пептидов в плазме после 15-минутной инкубации с «Глутоксимом» в концентрации 10 мкг/мл и 1 мкг/мл выше, чем после 30-минутной. Такая же динамика наблюдается и для действия ЛПС, но не fMLP (табл. 2), для которого в данных условиях не выявлена секреторная активность.

Секреция миелопероксидазы, как и лактоферрина, осуществляется под действием всех испытуемых стимуляторов, причем при стимуляции «Глутоксимом» и ЛПС концентрация белка в плазме после 15-минутной инкубации была выше, чем после 30-минутной (табл. 2). 

Из литературы известно, что ЛПС-индуцированная стимуляция нейтрофилов может быть ингибирована пентоксифиллином - ингибитором фосфодиэстеразы [4].

Мы исследовали действие этого ингибитора на глутоксим-стимулированную секрецию нейтрофильных пептидов и белков и установили, что добавление пентоксифиллина полностью блокирует секрецию исследуемых белков и пептидов (табл. 2).

Таблица 2. Содержание лактоферрина, МПО и дефенсинов в плазме крови после инкубации (15 или 30 минут) со стимуляторами

* - p<0,05 по сравнению с соответствующим контролем (15 или 30 минут инкубации)

# - p<0,05 по сравнению с соответствующей группой (стимулятором) при 15-минутной инкубации

Работа поддержана ЗАО «ФАРМА ВАМ» (договор № 02/08-ДП), грантами РФФИ № 12-04-01498 и № 12-04-01573

Заключение

Таким образом, установлено, что иммуномодулирующий препарат «Глутоксим» оказывает стимулирующее действие на секрецию белков и пептидов из гранул нейтрофильных гранулоцитов. «Глутоксим», так же как ЛПС и N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин, проявляет большую дегранулирующую активность в условиях цельной крови, по сравнению с культурой изолированных нейтрофильных гранулоцитов. Показано, что более длительная инкубация цельной крови с «Глутоксимом» и ЛПС сопровождается снижением уровня нейтрофильных белков и пептидов в плазме, что позволяет предположить, что стимуляция «Глутоксимом» и ЛПС, в отличие от стимуляции N-формил-метионил-лейцил-фенилаланином, может приводить к активации рецепторного аппарата клеток крови и связыванию секретируемых соединений с клетками. Секреторное действие «Глутоксима» связано с работой фосфодиэстераз, так как блокируется добавлением ингибитора фосфодиэстераз - пентоксифиллина.

Киселева Е.П., д.м.н., в.н.с. отдела иммунологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.

Ермоленко Е.И., д.м.н., зав. лабораторией молекулярной биологии и генетики микробов отдела молекулярной микробиологии, ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург.