Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Аллатрам – амид N–аллилантраниловой кислоты – новое биологически активное соединение, обладающее противовоспалительным эффектом. Исследование фармакологической активности на разных моделях воспалений (каррагениновой, серотониновой, гистаминовой и формалиновой) при внутрибрюшинном и пероральном введении показало, что амид N-аллилантраниловой кислоты не уступает диклофенаку натрия, а по анальгетической и жаропонижающей активности проявляет эффект на уровне препарата сравнения, проявляет слабое ульцерогенное действие и является практически нетоксичным по классификации Сидорова [7,8].

В связи с рекомендацией к проведению доклинических испытаний нами проводятся исследования по разработке методов контроля качества и стандартизации субстанции [1,2,4].

Согласно литературным данным [9] амид N-аллилантраниловой кислоты впервые был получен взаимодействием N-аллилизатового ангидрида с раствором аммиака, который порциями приливали в течение 15 мин. Полученную суспензию разбавляли водой (50–100 мл) и перемешивали 15 ч:

Схема 1

Выделившийся осадок отфильтровывали, промывали водой до нейтральной реакции среды, сушили под вакуумом при 50 oС, перекристаллизовывали из смеси циклогексана и этилацетата. Температура плавления соединения 145–146 0С.

Аллатрам получен нами реакцией алкилирования амида антраниловой кислоты бромистым аллилом при перемешивании в водной среде без нагревания (при комнатной температуре) в течение 1 ч [7,8]:

Схема 2

Полученное соединение представляет собой белый кристаллический порошок, который практически не растворим в воде, легко растворим в диметилформамиде и ацетоне, мало растворим в этаноле 96 % и хлороформе. Температура плавления 140–142 0С. Структура полученного соединения подтверждена данными ИК- (спектрометр «Specord M-80» в дисках с калия бромидом в области от 4000 до 400 см-1), ЯМР1H- (Фурье-спектрометр фирмы Tesla BS-567A (рабочая частота 100 МГц) в дейтерированном диметилсульфоксиде, внутренний стандарт – ГМДС) и хроматомасс – спектров (хроматомасс-спектрометр «HP-6890» c МСД-5973 в хлороформе) [1,7]. Для обнаружения посторонней (специфической) примеси амида антраниловой кислоты в аллатраме предложены методы обращённо-фазной ВЭЖХ [6] и ТСХ [1,2]. Предельное содержание хлоридов, сульфатов и солей аммония определяют согласно требованиям Государственной фармакопеи [2,5].

Для разработки методик количественного определения нами проведен анализ исследуемой субстанции классическим и видоизмененным методом Къельдаля. Классический метод основан на сжигании соединения в присутствии концентрированной серной кислоты, а видоизменённый – на гидролизе амидной группы в щелочной среде. Полученные данные свидетельствуют, что оба варианта метода Къельдаля дают сопоставимые результаты, но проект ФС мы включили более простой в исполнении – видоизмененный метод Къельдаля [1,3,5].

Целью настоящей работы явилось изучение качества различных серий субстанции аллатрама для модификации методики синтеза указанного соединения.

Материалы и методы исследования

В исследованиях использовался высокоэффективный жидкостный хроматограф «Shimadzu LC Prominence» (Япония), оснащённый колонкой из нержавеющей стали (25см×4,6мм, сорбент Discovery® С18 с размером частиц 5 мкм) и диодноматричным детектором.

Разработанные условия хроматографического анализа:

• подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1% раствор трифторуксусной кислоты (30:70);
• скорость потока подвижной фазы – 1 мл/мин;
• длина волны детектирования – 212 нм;
• объем вводимой пробы - 20 мкл;
• температура термостата колонки – 40 °С [4].

В методе ТСХ применялись пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-В» (ТУ 26-11-17-89); подвижная фаза хлороформ: спирт этиловый 96 % (9:1). При определении данным методом субстанцию и примесь амида антраниловой кислоты растворяли в ацетоне, наносили на хроматографическую пластинку и хроматографировали восходящим способом. Затем пластинку сушили и обрабатывали парами йода в затемненной йодной камере в течение 10 мин. Отмечали появление желто-коричневых пятен [1,2].

Приготовление реактивов для определения примесей хлоридов, сульфатов и солей аммония в субстанции аллатрама и его количественного содержания проводили по методикам Государственной фармакопеи [5].

В работе использовали пять серий субстанции аллатрама, синтезированные на кафедре фармацевтической химии ФОО ПГФА в 2008-2012 гг. Все исследования выполнены не менее чем в трех повторностях.

Результаты исследований и их обсуждение

Проведен анализ двух серий субстанции аллатрама (серии 06.2008 и 04.2009), на соответствие требованиям ФС, полученных по методике: к раствору амида антраниловой кислоты в воде при постоянном перемешивании по каплям добавляли бромистый аллил при комнатной температуре в течение часа. Полученную смесь нейтрализовали карбонатом натрия до pH=7 по универсальной индикаторной бумаге. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали холодной водой 2 раза по 20 мл, сушили и перекристаллизовывали из смеси воды с этанолом (2:1). Перекристаллизованный осадок высушивали при температуре 90 оС в сушильном шкафу.

Полученные серии субстанции аллатрама исследовали по показателям ФС: «Посторонние примеси», «Хлориды», «Сульфаты», «Соли аммония», «Количественное определение». Результаты анализов приведены в таблице 1. Указанные серии субстанции не соответствуют требованиям стандарта по показателям «Посторонние примеси», «Соли аммония», «Количественное определение», что свидетельствует о частичном разложении (гидролизе) аллатрама, произошедшем при получении или хранении соединения.

Таблица 1

Результаты анализа 2-х серий субстанций аллатрама, полученных по ранее используемой методике

В связи с завышенным содержанием солей аммония и заниженными результатами количественного содержания методика синтеза аллатрама была подвергнута модификации: изменены условия сушки субстанции, т.к. предположительно гидролиз мог пройти в процессе высушивания.

Установлено, что при использовании температурного режима 18–20 оС процесс высушивания занимал длительное время: 20–24 ч. Оптимальной явилась модифицированная методика, при которой сушка проводится в сушильном шкафу при температуре, не превышающей 60 оС.

Полученные по модифицированной методике серии 12.2010, 11.2011, 10.2012 субстанции аллатрама исследованы на соответствие требованиям ФС. Результаты анализов (таблица 2) свидетельствуют о приемлемости модифицированной методики синтеза, а также об устойчивости субстанции в процессе хранения (не менее двух лет).

Таблица 2

Результаты анализа 3-х серий субстанций аллатрама, полученных по модифицированной методике

Выводы

1. Анализ двух серий субстанции аллатрама показал их несоответствие требованиям ФСП по показателям «Посторонние примеси», «Соли аммония», «Количественное определение», что свидетельствует о частичном разложении соединения.

2. Проведена модификация методики получения субстанции аллатрама: предложено проведение высушивания субстанции в сушильном шкафу при температуре, не превышающей 60 оС.

3. Исследование трех серий субстанции на соответствие требованиям ФСП свидетельствует о приемлемости модифицированной методики синтеза, а также об устойчивости субстанции в процессе хранения.

Рецензенты:

Гейн В.Л., д.х.н., профессор, заведующий кафедрой общей и органической химии ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.

Хомов Ю.А., д.х.н., профессор кафедры фармацевтической химии ФДПО и ФЗО ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.