Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение.

В последние годы большой интерес вызывают генетически модифицированные организмы (ГМО), получение которых связано со «встраиванием» чужого гена в ДНК других растений или животных с целью изменения свойств или параметров последних [1]. Для встраивания гена используют вирусы, транспозоны или плазмиды (кольцевые ДНК), способные проникнуть в клетку организма и использовать клеточные ресурсы для создания множества собственных копий или внедриться в клеточный геном (как и «выпрыгнуть» из него) [14]. Однако до сих пор неясно, как вновь созданные    ГМ-организмы взаимодействуют с другими организмами, влияют на них и их      потомство.

Все больше поступает данных о том, что ГМО приводят к нарушению репродуктивных функций и патологическим изменениям во внутренних органах как у насекомых [2, 4], так и у млекопитающих [3,5, 8, 9,10,11].

В приведенных выше работах указывалось на серьезные изменения во внутренних органах животных, независимо от того, какой сорт или линия ГМ-культуры использовались. Предполагается, что одной из причин опасности ГМО может быть несовершенство самого процесса внедрения гена в геном другого организма [1,12]. Плазмиды и ГМ-вставки были обнаружены в крови и клетках разных органов животных и человека, использующих в пищу ГМО [6, 8, 9].

В литературе практически отсутствуют данные о влиянии разных линий ГМО на потомство млекопитающих. Целью настоящей работы было исследование воздействия ГМ-сои (RR, линия 40.3.2), устойчивой к гербициду раундапу, на физиологическое состояние и выживаемость крысят первого и второго поколений.

Методика.

В экспериментах участвовали 4 группы крыс Вистар, весом 200-220гг. Самок крыс первой группы («Контроль») кормили стандартным виварным кормом без каких-либо добавок. Самки трех других групп получали к корму добавку в виде соевой пасты, полученной в результате разведения соевой муки водой (20г*40 мл воды). Так, самкам второй группы к стандартному виварному корму добавляли пасту, приготовленную из муки ГМ сои, устойчивой к гербициду раундапу (трансген EPSPS CP4, Roundup Ready - RR, линия 40.3.2, содержание белков ~ 35%). Самкам третьей группы к корму добавляли пасту из муки Изолята белка   ГМ-сои (RR, линия 40.3.2, содержание белков ~ 90%), а четвертой - из муки традиционного сорта сои Arcon SJ 91-330 (содержание белков ~35%). Муку ГМ сои и Трад. сои получали путем помола соевых семян в соответствующих компаниях. В составе стандартного виварного корма не было сои или соевого шрота. Перед началом экспериментов образцы соевой муки были проверены на наличие трансгенов в специальной лаборатории. Проверка осуществлялась слепым методом (рис. 1). Таким образом, в экспериментах участвовало четыре группы крыс:

• 1-я группа - «Контроль»,
• 2-я группа - «ГМ-соя»; 
• 3-я группа - «Изолят белка ГМ-сои»,  
• 4-я группа - «Трад. соя».

Животные находились в одном помещении и в одинаковых условиях.

Рис.1. Электрофореграммы продуктов ПЦР с ДНК из биологических образцов.

Образец №2 (треки 1,2) -  ГМ-соя (мука)

Образец №3 (треки 3,4) -  Трад. Соя (мука)

Образец №4 (треки 5,6) -  Изолят белка ГМ-сои (мука)

Образец №5 (треки 7,8) -   Трад Соя (семена)

Образец №6 (треки 9,10) -  ГМ-соя  (семена), t^о

Образец №7 (треки 11,12) -ГМ-соя  (семена)

Сою добавляли к виварному корму самкам крыс Вистар за две недели до спаривания, во время спаривания, беременности и выкармливания крысят. Процедура эксперимента была следующей. В каждой клетке находилось по три самки, которым к стандартному виварному корму добавляли соевую пасту: на каждую крысу по 6-7 г соевой муки. Соевую пасту ставили в отдельной плошке внутрь клетки. Через две недели после начала кормления в клетку самок подсаживали по очереди двух самцов (по три дня каждый). Перед рождением крысят каждую самку отсаживали в отдельную клетку. После рождения крысят количество сои увеличивали до 1г на одного родившегося крысенка, а после того, как крысята подрастали и начинали есть сами, увеличивали до 2-3г. Подсчитывали количество родивших самок, число рожденных и умерших крысят. У крысят, родившихся, приблизительно, в одно и то же время (+1-2 дня), определяли массу тела (~80% крысят от общего количества). Всего было исследовано 30 самок и 221 крысенок.

Статистический анализ.

Для статистического анализа уровня смертности использовали One-Way ANOVA с применением Newman-Keuls теста для долевого участия; для анализа веса использовали Mann-Whitney, для распределения веса у крысят - Chi-square в программе StatSoft Statistica v6.0 Multilingua (Россия).

Результаты.

Анализ данных показал, что после добавления к общевиварному корму самок за две недели до спаривания, во время спаривания, беременности и лактации генетически модифицированной сои в группах «ГМ-соя» была выявлена высокая смертность крысят (~ 51,6%), которая была статистически достоверно выше, чем смертность крысят в группах «Изолят белка ГМ сои» (15,1%), «Трад. соя» (10%) и «Контроль» (8,1%) (табл.1).

Таблица 1. Данные смертности крысят через три недели 

*- по сравнению с группой «ГМ-соя»

Высокая  смертность  крысят  наблюдалась у всех самок из группы «ГМ-соя» (табл.2). Уровень смертности крысят в группе «Изолят белка ГМ-сои» был ниже, чем в группе «ГМ соя», но выше, чем в группах «Трад. Соя» и «Контроль» (табл.1). В последних двух случаях различие было статистически недостоверным.

ГМ соя не повлияла на рождаемость крысят: в среднем на одну самку было 10-11 крысят как и в группах «Контроль» и «Трад. соя» (табл.1). В то же самое время рождаемость крысят в группе «Изолят белка ГМ-сои» была достоверно ниже, чем в других группах (в среднем на одну самку ~8 крысят).

Смертность крысят в группах «Контроль», «Трад. соя» и «Изолят белка ГМ-сои» наблюдалась в течение двух недель, а в группе «ГМ-соя» - в течение трех недель.

Таблица 2. Число умерших крысят в группе «ГМ-соя» 

Через две недели после рождения определяли вес большей части крысят (~80%),  родившихся, примерно, в одно и то же время  + 1-2 дня. Анализ показал пониженный вес у крысят из группы «ГМ-соя» по сравнению с весом крысят из групп «Трад. соя» и «Конт-роль» (табл.3), при этом более трети крысят из группы «ГМ-соя» имели очень низкий вес (менее 20г) по сравнению с группами «Контроль» и «Трад-соя», что свидетельствовало об ослабленном состоянии большого количества крысят из группы «ГМ-соя» (табл.3, рис. 2). Были также обнаружены небольшие изменения по ряду изучаемых параметров и при добавлении традиционной сои (табл.3). Так, вес основной части крысят из группы «Трад. соя» был меньше, чем вес крысят из «Контроля», и, в основном, приходился на интервал от 20 - 30г (табл.3).

Таблица 3. Распределение веса крысят через две недели после рождения в разных группах 

*- по сравнению с группой ГМ-соя

При спаривании самок и самцов первого поколения (F1) из группы ГМ-соя не удалось получить потомство. При этом схема кормления была разной. В первой группе 12 самок F1 и 12 самцов F1 подкармливали ГМ соей до и во время спаривания. В другой группе 12 F1 самок и     12 самцов F1 прекратили кормить до спаривания. В обеих группах потомство       F2 не получили. В третьей группе 12 самок F1 из группы «ГМ-соя» спаривали с 12 самцами из группы «Контроль», родители которых были без соевой диеты. До начала и во время спаривания животные получали обычной корм без сои. Потомство удалось получить у 75% крыс. При этом количество крысят у одной самки в среднем (~ 8)  было меньше, чем в группе «Контроль» (~11 крысят).

Таким образом, были выявлены серьезные статистически достоверные изменения по развитию и выживаемости крысят из группы «ГМ-соя» по сравнению с крысятами из групп «Трад соя», «Изолят белка ГМ-сои» и «Контроль».

Обсуждение.

Было выдвинуто несколько версий негативного влияния ГМ сои на потомство. Действие ГМ сои могло быть связано с неустойчивостью и нестабильностью генетической конструкции и проникновением чужеродных генов, в том числе и фрагментов плазмид, в клетки репродуктивных органов и в половые/стволовые клетки животных согласно многочисленным экспериментальным данным [6,8,9]. Нестабильность генетической вставки была показана для трансгенной сои [13].  Не исключено и мутагенное воздействие вновь созданных ГМ-организмов на животных, поглощающих их [1, 12]. Причиной негативного влияния могло быть накопление токсичного гербицида раундапа в растениях, устойчивых к нему, и, таким образом, вместе с растением поглощалось и само токсическое вещество [7]. В связи с тем, что поскольку ни самки, ни подросшие крысята, которые начинали сами есть ГМ сою, не умирали, то предполагается, что наиболее вероятными являются первые три версии. Подтверждением этих версий является и отсутствие высокой смертности крысят, матерей которых подкармливали мукой изолята белка ГМ-сои, содержащей, в основном, белки. Полученные данные свидетельствуют о том, что включенная в корм соя, модифицированная геном EPSPS CP4, может представлять определенную опасность для живых организмов, приводя к повышенной смертности и недоразвитости части новорожденных крысят первого поколения и отсутствию второго  поколения.

Рис. 2. Крысята одного возраста (19 дней) из двух разных групп:
большой нормальный крысенок - из группы "Контроль",
маленький недоразвитый крысенок - из группы "ГМ-соя".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

• 1. Кузнецов В.В., Куликов А.М. // Российский химический журнал. 2005. 69 (4). С.70.
•  2. Birch A.N.E., Geoghegan I.E., Majerus M.E.N., Hackett C., Allen J.//Vet Hum Toxicol. 2003. 45(2). P.68.
•  3. Ewen S.W, Pusztai A.// Lancet.           354 (9187). 1999.
• 4. Losey J.E., Rayor L.S., Carter M.E.// Nature.1999. 399. P.214.
• 5. Malatesta M.,  Caporalony C.,  Gavaudan S., Rocchi M.B.L., Tiberi C., Gazzanelli G.// Cell Struct. Funct. 2002. 27. P.173.
•  6. Netherwood T., Bowden R., Harrison P., O'Donnell A.G., Parker D.S., Gilbert H.J.Gene// Appl Environ Microbiol. 1999. 65(11). P. 5139.
• 7. Richard S, Moslemi S, Sipahutar H, Benachour N. and Seralini GE// Environ. Health Perspect. 2005. 113 (6). 716.
• 8. Schubbert R., Hohlweg U., Renz D. and Doerfler W.// Molecules, Genes and Genetics. 1998. 259. P.569.
• 9. Schubbert R., Lettmann C., Doerfler W.// Molecules, Genes and Genetics. 1994. 242. P.495.
• 10.  Seralini  G.E.,   Cellier  D.,   Vendomois JS. //Arch. Environ. Contam. Toxicol, 2007. 52(4). P.596.
• 11. Vecchio L., Cisterna B., Malatesta M., Martin T.E., Biggiogera B.// Eur. J. Histochem. 2003. 48. P.449.
• 12. Wilson A., Latham J., Steinbrecher R.// Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 2006. 23. P.209.
• 13. Windels P., Taverniers I., Depicker A., Van Bockstaele E., De Loose M.// Eur. Food Res. Technol., 2001. 231. P.107.
• 14. World Scientists Statement. Supplementary Information of the Hazards of Genetic Engineering Biotechnology. Third World Network, 2000.