Введение
В настоящее время нанотехнологии являются одним из важнейших направлений технологического развития во многих странах. Наноматериалы и изделия из них стали применять в различных областях науки и техники: от аэронавтики до микро- и наноэлектроники, от биотехнологии до генной инженерии [3]. Интерес к наночастицам вызван высокой степенью измельчения, при которой существенно изменяются физико-химические свойства (механические, электропроводные, каталитические, биологические и др.) практически всех химических веществ. Кроме того, размеры наночастицы и свойства их поверхностей позволяют им вступать в прямой контакт на молекулярном уровне с биологическими тканями и системами, с инфекционными агентами, эндотоксинами, токсинами, в том числе микотоксинами, а также с различными химическими соединениями органической и неорганической природы (протеинами, липидами, нуклеиновыми кислотами) и отдельными структурами клеток [1, 2, 5, 7, 9-21]. Быстрое развитие нанотехнологий сопровождается повышением уровня воздействия наночастиц на биообъекты, при этом информации об их потенциальной опасности для здоровья недостаточно [6]. В доступной нам литературе отсутствует информация о влиянии наноразмерных частиц на состояние метаболических процессов в организме крыс в период беременности по биохимическим показателям крови, что и стало целью нашего исследования.
Материалы и методы исследования
Исследования выполнены в условиях экспериментально-биологической клиники (вивария) Оренбургского государственного университета на белых лабораторных крысах линии «Wistar» при гестации. Контрольные и экспериментальные группы формировались из шестимесячных самок массой 250-300 г (n = 40). Крысы находились в стандартных условиях с естественной сменой освещения и полноценным рационом питания. У всех животных был свободный доступ к пище и воде. В работе использовали высокодисперсный нанопорошок меди. Наночастицы меди типа Cu10x представляют собой сферические частицы размером 103,0±2,0 нм с оксидной пленкой толщиной 6 нм, полученные в Институте энергетических проблем химической физики РАН (Москва). Методом рентгенофазового анализа определен их состав: меди кристаллической - 96%, меди оксида - 4%. Эксперимент включал в себя два последовательных периода: 1 - уравнительный (продолжительность - 14 сут.), 2 - учетный (продолжительность - 20 сут.). В ходе первого периода проводили формирование максимально однородных групп. В ходе учетного периода животные были разделены на четыре группы. Первая экспериментальная группа получала нанопорошок меди из расчета 2 мг/кг; вторая группа - 1 мг/кг; третья группа - 0,5 мг/кг. Четвертая группа являлась контрольной, животным внутримышечно вводили физиологический раствор в количестве 0,2 мл. Выбранные концентрации наночастиц меди не превышали максимально переносимых доз для данного металла. Раствор наночастиц вводили самкам с ранних сроков беременности внутримышечно в бедренную группу мышц с соблюдением правил асептики и антисептики с интервалом 3дня в количестве 6 инъекций. Для приготовления взвеси наночастиц меди использовали ультразвуковую ванну. По окончании эксперимента производили забор крови. Забой животных проводили под небуталовым наркозом на 19-20-й день беременности. Экспериментальная часть работы была выполнена в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009; Карпищенко Н.Н., 2010).
Определение биохимических показателей крови проводили с помощью полуавтоматического биохимического анализатора «Climaplus». Для работы на анализаторе использовали стандартные наборы реактивов.
В сыворотке крови определяли следующие показатели: общий белок (биуретовым методом); альбумины (по реакции с бром крезоловым зеленым); глюкозу (глюкозооксидазным методом); общий билирубин (по реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой); креатинин (по реакции Яффе); мочевину (уреазным глутамат дегидрогеназным методом); мочевую кислоту (фосфорно-вольфрамовым методом); общий холестерин (холестерол оксидазным методом); триглицериды (ферментативным методом); активность ферментов (кинетическим методом).
Данные эксперимента обрабатывали статистически с использованием программ Excel, Statistica 5.
Результаты и их обсуждение
В ходе эксперимента беременность животных первой группы прервалась после введения второй дозы препарата, тем не менее, им было продолжено введение наночастиц. У крыс второй и третьей опытных групп течение беременности не отличалось от самок контрольной группы. У животных отсутствовали изменения в поведенческих реакциях, во внешних признаках (волосяном покрове, видимых слизистых). Крысы адекватно прибавляли в массе. На 20-й день беременности все плоды были жизнеспособны, без видимых пороков развития, соответствовали сроку гестации.
Из таблицы видно, что под влиянием наночастиц, введенных животным внутримышечно, происходило статистически достоверное снижение концентрации общего белка в сыворотке крови во всех опытных группах. Наиболее выраженный биологический эффект в отношении белкового обмена оказывали наночастицы меди в концентрации 2 мг/кг. Подтверждением влияния наночастиц на белоксинтезирующую функцию печени является снижение в опытных группах сывороточного альбумина, синтез которого происходит главным образом в печени.
Функциональную активность печени также характеризуют такие показатели, как уровень в плазме крови общего билирубина, аминотрансфераз (ЩФ, АлАт, АсАт). Самые низкие значения билирубина были зафиксированы в первой группе (более чем в 2 раза). Во второй и третьей опытных группах также имелось достоверное снижение уровня общего билирубина по сравнению с контрольной группой.
Изменение биохимических показателей сыворотки крови самок беременных крыс под влиянием наночастиц меди.
|
Показатель крови |
1-я опытная |
2-я опытная |
3-я опытная |
Контроль |
|
Общий белок |
62,1±0,5* |
77,8±3,5* |
77,7±1,5* |
86,7±1,8 |
|
Альбумины |
32,1±0,3* |
32,2±0,3* |
32,0±0,4* |
46,7±0,9 |
|
Глюкоза |
7,7±0,2* |
8,5±0,1 |
7,1±0,5* |
8,6±0,3 |
|
Билирубин |
1,4±0,2* |
2,1±0,1* |
2,3±0,1* |
3,6±0,2 |
|
Мочевина |
7,8±0,3* |
12,0±0,4 |
13,4±1,4 |
11,3±1,3 |
|
Мочевая кислота |
120,7±9,1 |
595,8±19,3* |
531,7±35,3* |
129,3±3,5 |
|
Креатинин |
68,9±1,3* |
100,0±0,0 |
110,0±0,0 |
105,3±6,5 |
|
Триглицериды |
0,6±0,1* |
4,1±0,4 |
2,0±0,3* |
4,8±0,9 |
|
Холестерин |
1,3±0,1* |
2,4±0,1 |
2,5±0,1 |
2,7±0,1 |
|
АлАт |
82,3±3,5 |
77,7±13,2 |
67,3±10,0 |
72,7±5,5 |
|
АсАт |
260,4±13,6* |
565,8±25,6* |
389,7±28,6* |
101,0±8,4 |
|
ЩФ |
552,6±30,1* |
83,3±5,7 |
82,8±13,0* |
70,0±1,2 |
|
Амилаза |
487,57±15,6* |
1478,7±35,8* |
1491,2±98,0* |
591,7±17,8 |
* Статистически достоверные отличия (р ≤ 0,05).
Аланин - и аспартатаминотрансфераза синтезируются внутриклеточно в печени и попадают в кровь в результате цитолиза при ее повреждениях. Хотя отсутствует изменение уровня АлАт, снижение билирубина, достоверное повышение уровня аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы у крыс, получавших наночастицы меди, по сравнению с контрольной группой, свидетельствуют о наличии повреждений печеночной ткани. Мочевина крови, являясь конечным продуктом распада белков, позволяет судить о работе почек. Показатель креатинина, продукта почечного обмена белков, определяется с мочевиной и отражает функцию гломерулярного аппарата почек. Достоверных изменений этих показателей в условиях нашего эксперимента во второй и третьей опытных группах выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии патологических процессов в почках крыс. Однако выявлено значительное увеличение уровня мочевой кислоты в этих группах. Изолированный рост данного показателя в отсутствии роста мочевины и креатинина, возможно, связан с наличием беременности у крыс этих групп. Это предположение подтверждается низким уровнем мочевой кислоты в первой опытной группе, где беременность прервалась на ранних сроках. Обращает на себя внимание достоверное снижение креатинина и мочевины у самок первой опытной группы, что подтверждает повреждение ткани печени, так как синтез мочевины происходит в гепатоцитах. При оценке показателей холестерина и триглицеридов, характеризующих липидный обмен в организме, получены следующие данные. Достоверных изменений уровня холестерина между контрольной, второй и третьей опытными группами выявлено не было. Отмечено достоверное снижение триглицеридов в третьей опытной группе в сравнении с контролем более чем в два раза. Наибольшее снижение уровня триглицеридов и холестерина наблюдалось при введении максимальных концентраций меди (первая группа). Холестерин в этой группе снижен в 2 раза, а уровень триглицеридов в 8 раз по сравнению с контролем. При оценке показателей углеводного обмена выявлено, что уровень сахара крови снижен во всех опытных группах. Значительное снижение наблюдалось в первой и третьей экспериментальных группах. Гипогликемия, наблюдаемая при тяжелых заболеваниях печени, указывает на ее повреждение. Механизмы развития гепатогенной гипогликемии обусловлены нарушениями целого ряда метаболических путей превращения углеводов в печени. Одним из ферментов, принимающих участие в углеводном обмене, является амилаза крови. Вырабатываясь в поджелудочной железе, она характеризует ее морфофункциональное состояние. Выявлено достоверное повышение амилазы во второй и третьей группах (практически в 3 раза), что указывает на повреждение ткани поджелудочной железы у этих крыс.
Заключение
Таким образом, максимальная концентрация наночастиц меди при внутримышечном введении привела к прерыванию беременности на ранних сроках. При введении меди в концентрации 0,5 и 1 мг/кг соответственно беременность пролонгировалась, ее течение не отличалось от крыс контрольной группы и плоды на 20-й день беременности были жизнеспособны, без видимых пороков развития, соответствовали сроку гестации. Наночастицы меди при парентеральном введении в большей степени оказывали влияние на функциональное состояние печени (страдает белковый, углеводный, жировой обмен). При этом наиболее выраженное биологическое действие наночастиц выявлено у крыс, получавших максимальную концентрацию меди.
Рецензенты:
Мирошников С.А., д.м.н., профессор, ФГБОУ ВПО «Оренбургский Государственный университет», г.Оренбург.
Лебедев С.В., д.б.н., ФГБОУ ВПО «Оренбургский Государственный университет», г.Оренбург.