Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,006

SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM IN THE CATTLE POPULATION OF RED STEPPE BREED

Lyukhanov M.P. 1 Korotkevich O.S. 1 Sebezhko O.I. 1 Yudin N.S. 2
1 Novosibirsk state agrarian university
2 Institute of Cytology and Genetics, SB of the Russian Academy of Sciences
The paper presents frequencies of TNF-α -824 A/G alleles and genotypes and associations of single nucleotide polymorphism with biochemistry parameters of blood and milk productivity indices in Red Steppe cattle. The frequencies of genotypes A/A, A/G and G/G were respectively 0.260, 0.460 and 0.280. A and G allele frequencies were 0.490 and 0.510. The association of TNF-α-824 A/G single nucleotide polymorphism with milk productivity indices was revealed. Homozygous for the TNF-α A/A cows had the yield and speed of lactation higher than the animals of other genotypes. Upward trend in the total protein content was observed in the homozygous A/A individuals. The regularities in the association of TNF-α gene polymorphism with zootechnical indices are true for the concerned population of Red Steppe cattle bred under the certain environmental conditions, the level of productivity and the current time period of breeding
milk production.
Red Steppe breed
biochemistry
cattle
single nucleotide polymorphism
tumor necrosis factor-α

Введение

При создании и совершенствовании пород и типов животных, адаптированных к различным экологическим условиям, важна оценка генофонда и фенофонда популяций сельскохозяйственных животных разных видов Сибири по продуктивности [8, 11, 31, 36 - 38], генетической структуре [2, 17, 18, 39], биохимическому, иммунологическому, гематологическому [43], цитогенетическому [1, 19, 21], химическому [10, 13, 14, 28, 34, 49 - 51] статусу, резистентности к болезням [5, 26, 29, 30, 33] и воспроизводительной способности [4, 16, 40].

Содержание химических элементов в органах и тканях может являться маркером загрязнения окружающей среды и его влияния на популяции сельскохозяйственных животных [9, 24, 35, 44]. Показана наследственная обусловленность резистетности животных разных пород к аккумуляции химических элементов в органах и тканях [12, 15]. Поэтому при разведении животных, на территориях подвергшихся антропогенному воздействию, возможна селекция на устойчивость к накоплению тяжелых металлов в органах и тканях.

Одной из важных проблем изучения генофонда и фенофонда пород является их оценка по резистентности к болезням, которые являются основной причиной выбытия животных [6, 20, 42]. Обнаружены межпородные различия по устойчивости и восприимчивости к заболеваниям, что указывает на роль наследственных факторов в детерминации этих признаков [25]. Красная степная порода была более устойчива к болезням конечностей и лейкозу, чем черно-пестрая [27]. Давление отбора по признакам продуктивности, устойчивости к болезням может изменять генетическую структуру популяций. Поэтому при изучении генофонда пород необходимо проводить постоянный мониторинг структуры популяций крупного рогатого скота по возможно большему числу полиморфных локусов.

Однонуклеотидный полиморфизм (англ. Single nucleotide polymorphism, SNP) – это замена одного нуклеотида в молекуле ДНК в геноме особей одной породы (вида) или между гомологичными участками гомологичных хромосом. SNPS возникает в результате точечных мутаций. Однонуклеотидный полиморфизм широко используется в качестве молекулярно-генетических маркеров наследственных аномалий, продуктивности, устойчивости к болезням и т. д. Экспрессия генов в большей степени зависит от точковых мутаций в регуляторной части.

В настоящее время известно большое количество работ по изучению нуклеотидного разнообразия на уровне последовательностей ДНК. Практически все известные гены имеют полиморфные участки. Активно изучается нуклеотидный полиморфизм фактора некроза опухолей (ФНО в англоязычной литературе обозначается как TNF [tumor nekrosis factor]).

У некоторых пород однонуклеотидный полиморфизм (SNP) встречается во многих локусах. Известно, что ген TNF-α у крупного рогатого скота расположен на 23 хромосоме, локус 23q22 в регионе BoLA [48]. В этом гене известно около 30 полиморфных участков (в позициях -824, -793, -627 и т. д.), у половины из них установлено влияние на экспрессию белка in vitro [32, 48].

Наиболее полно изучен нуклеотидный полиморфизм гена TNF-α по -308 G/A положению [52, 53]. Установлена ассоциация однонуклеотидного полиморфизма гена TNF- α по -824 G/A положению с обменными процессами и другими признаками у крупного рогатого скота [46 - 48].

Ген TNF-α кодирует синтез внеклеточного белка фактора некроза опухоли (ФНО) альфа, который является многофункциональным противовоспалительным цитокином, синтезирующемся моноцитами и макрофагами [45]. Установлено, что ФНО влияет на устойчивость к инсулину, функционирование эндотелия, активирует лейкоциты, является одним из важных факторов защиты от внутриклеточных паразитов и вирусов [52].

Цель исследования – изучить частоту однонуклеотидного полиморфизма гена TNF-α -824 А/G, в популяции крупного рогатого скота красной степной породы и его связь с биохимическими показателями и молочной продуктивностью.

Материал и методы исследования

ДНК в крови 100 коров красной степной породы Алтайского края выделяли стандартными методами с использованием протеолитической, а затем фенольной экстракции. Фрагмент гена TNF-α крупного рогатого скота изучали с помощью ПЦР с использованием прямого праймера 5´-CCGAGAAATGGGACAACCT-3´ и обратного праймера 5´-GCCATGTATCCCCAAAGAAT-3´. Аллель-специфическую ПЦР (35 циклов) проводили в режиме: денатурация 30 сек при 95оС; отжиг 30 сек при 60оС; синтез 30 сек при 72оС. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала: 0,5 мкг ДНК, по 0,5 мкМ праймеров, 0,2 мМ каждого из dNTP, ПЦР-буфер (67 мМ Трис-НСl (рH 8,8), 1,5 мМ MgCl2, 98 мМо – меркаптоэтанол, 0,01% твин-20), 8% глицерин, 25 мМ Kcl и 1,25 ед. Taq-полимеразы. В продукт амплификации вносили эндонуклеазу рестрикции EcoICRi (CибЭнзим, Россия), а затем оценивали в 4% ПААГ, окрашивание проводили бромистым этидием.

При статистической обработке использовали критерий Стьюдента и χ2.

Биохимические параметры были изучены у 49 коров красной степной породы. Молочная продуктивность за 305 дней первой лактации проанализирована у 86 животных.

Биохимический анализ сыворотки крови генотипированных животных проводился по следующим показателям: общий белок крови, содержание альбуминов, АлАТ, АсАТ, щелочная фосфатаза, кислая фосфатаза общая и простатическая фракции, гаммаглутаминтрансфераза, α-амилаза, лактатдегидрогеназа, мочевина, креатинин, мочевая кислота, молочная кислота глюкоза, холестерин, триглицериды, липопротеиды высокой плотности, липопротеиды низкой плотности, билирубин и его фракции, кальций, фосфор, хлориды, железо, магний. Исследования выполнены с использованием реактивов «Вектор-Бест» (Россия). «Ольвекс-диагностикум» (Россия) и «Biocon» (Germany) на биохимическом полуавтоматическом анализаторе «Fotometer-5010» (Germany).

Все расчеты проводились с использованием программ МS Excel 2003 и Gnumeric 1.10.16.

Результаты исследования и обсуждение

Среди генотипированных по TNF-α - 824 A/G животных было выявлено соотношение генотипов 1,0 А/А: 1,77 A/G: 1,08 G/G, которое не отличалось от теоретически ожидаемого (табл. 1). Частота аллелей А и G была приблизительно одинаковая.

Таблица1

Частота генотипов и аллелей TNF-824 A/G в исследуемой популяции

Показатель

Генотип

Аллель

А/А

A/G

G/G

A

G

Количество

26

46

28

98

102

Частота фактическая

0,260

0,460

0,280

0,490

0,510

Теоретически ожидаемый

0,240

0,500

0,260

 

 

Все биохимические показатели находились в пределах нормы, что свидетельствует о нормальном состоянии здоровья животных. У гомозигот TNF-α -824А/А наблюдалась тенденция повышенного содержания общего белка. По остальным изученным биохимическим показателям не установлено достоверных различий между животными с различными генотипами (табл. 2).

Таблица 2

Некоторые биохимические параметры животных с различными генотипами

Показатель

Генотип

A/A

A/G

G/G

Общий белок, г/л

66,68±1,54

63,60±1,53

63,40±1,43

Альбумин, г/л

28,35±0,9

28,83±0,83

28,76±0,85

Глобулины, г/л

38,29±1,7

34,78±2,00

36,78±1,97

А/Г коэффициент

0,77±0,05

0,81±0,06

0,88±0,07

Щелочная фосфатаза, Е/л

149,83±7,29

156,67±9,44

156,67±9,44

В популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы нами ранее был изучен однонуклеотидный полиморфизм по TNF-α [22, 23]. Обнаружены межпородные различия по частоте генотипов и аллелей гена TNF-α -824. У животных красной степной породы частота гомозигот была практически одинаковой, тогда как у черно-пестрого скота соотношение гомозиготных особей значительно различалось. Частота гомозигот А/А была значительно выше, чем особей G/G [22].

Генетическая структура красной степной породы по эритроцитарным антигенам генетических систем групп крови также отличалось от черно-пестрого скота. У животных черно-пестрой породы была значительно выше частота антигенов I2(0,270), D1(0,245) и O1(0,504), чем у животных красной степной породы (соответственно 0,071, 0,0 и 0,165). В то же время встречаемость антигенов P2(0,076), Q1(0,074) и G2(0,114) у черно-пестрого скота была ниже, чем у животных красных пород (соответственно 0,357, 0,329 и 0,165) [38].

Следовательно, генетическая структура популяций красной степной породы и черно-пестрого скота по гену TNF-α -824 A/G и многим антигенам генетических систем групп крови значительно различалась.

Изучена связь генотипов по TNF-α -824 A/G с признаками молочной продуктивности у коров красной степной породы по 1 лактации (табл. 3).

Таблица 3

Ассоциация генотипов по 824 A/G с молочной продуктивностью

Генотип

Показатель

Надой, кг

Массовая доля

Скорость молоковыведения, кг/мин

жира,

%

белка,

%

А/А

3183,5±134,2

4,19±0,06

3,21±0,04

1,42±0,03

26

n

23

23

9

23

A/G

3856,5±141,0

4,19±0,04

3,21±0,02

1,45±0,02

46

n

42

42

17

42

G/G

4541,5±155,9

4,17±0,08

3,19±0,01

1,60±0,03

28

n

21

19

16

21

Установлены высокодостоверные различия по надою за 305 дней лактации между животными с разными генотипами. Надой гомозиготных G/G коров был в 1,4 раза выше (P<0,001), чем у животных гомозиготных по А/А. Гетерозиготные особи занимали промежуточное положение между продуктивностью двух групп гомозигот. В данном случае наблюдалось классическое промежуточное наследование количественного признака.

Такие же закономерности установлены и по скорости выведения молока. Она была выше у животных G/G, чем у коров других генотипов. По живой массе % жира и % белка различий между тремя группами животных не установлено. Таким образом, в изученной популяции скота красной степной породы одним из маркеров ранней оценки продуктивности животных можно использовать однонуклеотидный полиморфизм по гену TNF-α по -824 A/G положению. При отборе телок при прочих равных условиях следует отдавать предпочтение гомозиготным особям G/G. Важно отметить, что использовать этот маркер возможно в данной популяции и при существующем диапазоне уровня молочной продуктивности. В других популяциях ДНК-маркеры продуктивности могут быть установлены только после тестирования животных.

По черно-пестрой породе в хозяйстве с более высокой продуктивностью подобные связи нами не подтверждены. За 305 дней первой лактации различия между животными разных генотипов отсутствовали. Только за 100 дней первой лактации надой был больше у гетерозигот, чем у гомозигот (P<0,05) TNF-α -824 G/G.

Установленные закономерности в ассоциации ДНК-маркёров с продуктивностью животных верны для данной конкретной популяции животных, разводимых в определённых условиях среды, данного уровня продуктивности и существующего временного периода селекции. Предварительный отбор животных в раннем возрасте возможно проводить с последующим уточнением уровня продуктивности и состояния селекции. Эффект селекции на основе молекулярно-генетических маркёров, видимо, может снижаться с приближением к эколого-экономическому плато продуктивности сельскохозяйственных животных.

В огромном числе работ были описаны связи генетических, биохимических полиморфных систем, антигенов и аллелей генетических систем групп крови, аллотипов сывороточных белков с продуктивностью, заболеваемостью животных и другими признаками [7, 41]. В последние годы все большее значение придается поиску ДНК-маркеров, продуктивности, устойчивости к болезням, геномной селекции [3, 7, 31, 41]. Во многих работах такие ассоциации с признаками продуктивности обнаружены. Однако до сих пор по ряду количественных признаков надежных маркеров, используемых в практике селекции, не найдено.

Выводы

Впервые выявлен однонуклеотидный полиморфизм в популяции крупного рогатого скота красной степной породы Алтайского края по гену TNF-α по -824 A/G положению с соотношением генотипов 1,0 А/А : 1,77 A/G : 1,08 G/G.

Не обнаружено ассоциации изученных генотипов животных с биохимическими показателями.

Гомозиготные G/G коровы имели более высокие надой и скорость выведения молока, чем животные с другими генотипами. Надой у гетерозиготных особей занимал промежуточное положение по отношению к обоим гомозиготным генотипам. В изученной популяции красной степной породы генотипы особей по TNF-ɑ можно использовать в качестве ДНК-маркеров, некоторых показателей молочной продуктивности.

Работа была частично поддержана экспедиционным проектом СО РАН № 3Э

Рецензенты:

Мотовилов К.Я., д.б.н., профессор, Сибирский научно-исследовательский институт переработки сельскохозяйственной продукции СО Россельхозакадемии, заместитель директора, профессор кафедры стандартизации, метрологии и сертификации Новосибирского аграрного университета, г. Новосибирск.

Клименок И.И., д.с.-х.н., профессор, заместитель директора по науке, Сибирский научно-исследовательский институт животноводства СО Россельхозакадемии, г. Новосибирск.