Введение
Особенности скорости биотрансформации ксенобиотиков часто являются причиной различного эффекта от действия одной и той же дозы у разных организмов. Скорость биотрансформации определяется активностью цитохрома P-450.
Существуют различные адаптивные механизмы регуляции активности цитохрома P-450. Один из таких механизмов - индукция, то есть повышение концентрации и активности ферментов в ответ на действие ксенобиотика. К механизмам индукции относят: фенобарбиталовый, рифампицин-дексаметазоновый и этаноловый тип [2]. Одним из основных типов является фенобарбиталовый. Даже в небольших концентрациях препараты фенобарбиталового ряда способны к индукции многочисленных изоферментов цитохрома P-450: CYP2B6, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5 и др. Таким образом, в случае применения препаратов фенобарбиталового ряда мы можем оценить активность большого числа изоферментов цитохрома Р-450.
Известно, что введение препаратов фенобарбиталового ряда влияет на функции организма по механизму аутоиндукции, что ведет к изменению ответа организма на факторы внешней и внутренней среды. Кроме того, в доступной нам литературе нет единого критерия, позволяющего выделить фенотипические группы животных по активности изоферментов цитохрома P-450 [4].
Следовательно, возникает методическая задача оптимизировать дозировку препаратов фенобарбиталового ряда, применяемых для оценки активности изоферментов цитохрома P-450, с целью снижения эффекта от аутоиндукции и характеристики дискриминантной функции, позволяющей отнести животных к определенной фенотипической группе.
Материалы и методы
Основным прямым методом определения активности цитохрома P-450 у животных является фенотипирование in vivo [1].
В качестве модели оценки активности цитохрома P-450 был использован тест «гексеналового сна». Гексенал вводили крысам внутрибрюшинно в дозе 60 мг/кг. Время сна оценивали с момента потери рефлекса переворачивания до момента его восстановления [5]. Эксперимент проводился на 320 крысах-самцах линии Wistar, полученных из вивария ГБОУ ВПО «ЮУГМУ».
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью пакета программ прикладной статистики SPSS 17. Оценивали параметры распределения, проводили описательную статистику всей совокупности и двухэтапный кластерный анализ [3].
Результаты и обсуждение
На первом этапе мы провели описательную статистику всей совокупности (табл. 1) и проверили совокупность на нормальность распределения (рис. 1).
Таблица 1
Описательная статистика всей совокупности (время «гексеналового сна», мин)
|
N валидных (целиком) |
Среднее |
Стандартная ошибка (Среднее) |
Стандартное отклонение |
Асимметрия |
Стандартная ошибка (Эксцесс) |
Эксцесс |
|
320 |
27,58 |
1,345 |
24,059 |
0,534 |
0,272 |
-0,474 |
Рис. 1. Вероятностный график распределения всей совокупности (время «гексеналового сна»)
Для определения возможности распределения крыс на фенотипические группы был проведен двухэтапный кластерный анализ с автоматическим определением числа кластеров. Проведенный анализ показал, что действительно по времени «гексеналового сна» крысы распределяются на три фенотипические группы: «быстрые» (ultraextensive metabolism, UM), «медленные» (poor metabolism, PM) и «экстенсивные» (extensive metabolism, EM) метаболизаторы (рис. 2).
Рис. 2. Автоматическое определение количества кластеров
Далее мы провели статистический анализ совокупности, разбитой на кластеры. Результаты анализа для каждого кластера показаны в таблице 2, вероятностные графики для каждого из кластеров приведены на рисунке 3. Из представленных данных следует, что все кластеры характеризуются распределением, близким к нормальному.
Таблица 2
Описательные характеристики для каждого кластера
|
|
«Быстрые» метаболизаторы |
«Медленные» метаболизаторы |
«Экстенсивные» метаболизаторы |
|
|
Среднее |
3,18 |
58,47 |
29,40 |
|
|
95% доверительный интервал для среднего |
Нижняя граница |
2,28 |
55,79 |
27,73 |
|
Верхняя граница |
4,08 |
61,14 |
31,07 |
|
|
Стандартное отклонение |
5,024 |
12,777 |
8,767 |
|
|
Асимметрия |
1,275 |
1,619 |
-0,045 |
|
|
Эксцесс |
0,045 |
2,720 |
-1,356 |
|
|
Стандартная ошибка |
0,455 |
1,347 |
0,844 |
|
Рис. 3. Вероятностные графики (а - «медленные» метаболизаторы; б - «быстрые» метаболизаторы; в - «экстенсивные» метаболизаторы)
Рис. 4. Диаграмма распределения продолжительности «гексеналового сна» в зависимости от кластерной принадлежности (а - «медленные» метаболизаторы; б - «экстенсивные» метаболизаторы; в - «быстрые» метаболизаторы)
На рисунке 4 показаны диаграммы распределения продолжительности сна в зависимости от кластерной принадлежности.
На втором этапе статистической обработки результатов с целью расчета вероятности ошибочного распределение крыс на фенотипические группы по скорости «гексеналового сна» был проведен дискриминантный анализ. Дискриминантный анализ выполнялся для трех кластеров с расчетом нормированного и ненормированного коэффициента канонической дискриминирующей функции. Также рассчитывались значения центров групповых центроидов, которые позволяют определить принадлежность к кластеру. Поскольку переменная только одна - время «гексеналового сна», то и дискриминантная функция также была одна. На рисунке 5 приведены значения функции в центроидах групп для трех кластеров, позволяющие рассчитать принадлежность конкретного животного к тому или иному кластеру.
|
«быстрые» метаболизаторы |
«экстенсивные» метаболизаторы |
«медленные» метаболизаторы |
│- значения дискриминантной функции в центроидах кластера.
- интервал значений числовой прямой.
Рис. 5. Расположение по числовой прямой значений в центроидах дискриминантной функции (время «гексеналового сна») каждого из кластеров.
Как видно из рисунка 5, значения дискриминантной функции более 1,6105 позволяют отнести опытное животное к кластеру «медленных» метаболизаторов, значения дискриминантной функции от -1,251 до 1,6105 – к кластеру экстенсивных метаболизаторов и менее -1,251 – к кластеру «быстрых» метаболизаторов.
В таблице 3 приведены коэффициенты канонической дискриминантной функции.
Таблица 3
Коэффициенты канонической дискриминантной функции времени «гексеналового» сна
|
|
Значение |
|
Время гексеналового сна (k) |
0,111 |
|
Константа дискриминантной функции (С0) |
-3,056 |
Дискриминантная функция рассчитывается следующим образом: F(t)=C0+kt. Например, пусть время сна составило 10 минут, тогда F(t)= -3,056 +0,111• t, где t – время «гексеналового сна» в минутах, следовательно F(t)= -3,056 +0,111•10=-1,946. Соотносим данное значение с рисунком 5 и делаем вывод, что данное экспериментальное животное относится к группе «быстрых» метаболизаторов.
Таблица 4
Результаты дискриминантного анализа
|
|
Кластер |
Центроиды
|
Предсказание принадлежности к группе (%) |
Итого (%) |
||
|
«медленные» метаболизаторы |
«экстенсивные» метаболизаторы |
«быстрые» метаболизаторы |
||||
|
Исходные |
«медленные» метаболизаторы |
3,423 |
98,9 |
1,1 |
0,0 |
100,0 |
|
«экстенсивные» метаболизаторы |
0,202 |
0,0 |
94,4 |
5,6 |
100,0 |
|
|
«быстрые» метаболизаторы |
-2,704 |
0,0 |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
|
Результат дискриминантного анализа свидетельствует о том, что в общем случае 97,8% исходных наблюдений классифицировано правильно.
Таким образом, все животные по времени «гексеналового сна» были распределены по трем фенотипическим группам, что соотносится с данными литературы, и для каждой для них определены границы.
В результате проведенных исследований была рассчитана и охарактеризована дискриминантная функция, что позволило утверждать, что при использовании гексенала в концентрации 60 мг/кг сохраняется разделение животных на три фенотипические группы по активности изоферментов цитохрома P-450.
Рецензенты:
Головнева Е.С., д.м.н., профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО «ЮУГМУ» Минздрава России, г. Челябинск.
Рябинин В.Е., д.м.н., профессор кафедры биохимии ГБОУ ВПО «ЮУГМУ» Минздрава России, г. Челябинск.