Введение. Кальций, так же как натрий и калий, обеспечивая постоянство внутренней среды, участвует во многих процессах жизнедеятельности. И несмотря на то что суточная потребность кальция для взрослого человека около 1 г, в организме взрослого человека в виде различных малорастворимых соединений его находится от 1 до 2 кг кальция, при этом основная масса сосредоточена в костях, где он выполняет структурную функцию опорных тканей [1]. Кроме того, этот металл с 20-м порядковым номером в Периодической системе химических элементов Д.И. Менделеева оказывает и другие функции: транспортную, обеспечивая перенос различных веществ через мембраны; регуляторную, которая обусловлена способностью поддержания сосудистого тонуса и постоянства гемостаза, как IV фактора свертывающей системы крови; метаболическую - как триггер активации многих ферментов и протеинов и их ингибирования; защитную, благодаря участию в дезинтоксикационных, антистрессовых и антиаллергических процессах [1].
Регуляция обмена кальция осуществляется паратгормоном, кальцитонином и кальцитриолом [9], причем каждый из этих гормонов воздействует на разные звенья метаболизма кальция и органы-мишени. Так, паратгормон преимущественно влияет на резорбцию кости, повышая в крови содержание кальция, а в почках увеличивает обратное всасывание и активирует образование кальцитриола, преимущественное действие которого направлено на всасывание кальция из кишечника [1].
Несмотря на то что большая часть кальция, поступающего в организм человека, выделяется через желудочно-кишечный тракт (до 25 ммоль), в почках за сутки фильтруется до 270 ммоль, но, в зависимости от суточного ритма (максимум в утренние часы), уровня гормонов, кислотно-основного состояния, характера пищи (углеводы усиливают выведение кальция), экскретируется с мочой только от 1,5 до 15 ммоль. При этом 2/3 профильтровавшегося кальция с помощью ионных кальциевых каналов и АТФ-зависимых кальциевых насосов и обменных механизмов реабсорбируется в дистальных канальцах нефрона, 10-15% - в проксимальных, до 20% в петле Генле, и 2-8% в собирательных трубочках [1].
Так как в почках протекающие процессы аэробны и сопровождаются образованием таких токсических кислородных радикалов, как супероксидный анион радикал (О2•), перекись водорода (Н2О2), гидроксил перекиси (НО), синглетный кислород, озон, гипохлорит, пероксинитрит и другие [4], то будет логичным посмотреть состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в зависимости от различного уровня кальция, в частности при гиперкальциемии, создаваемое избытком витамина D, к тому же в литературе встречались данные о том, что гипервитаминозы D и А увеличивают образование активных форм кислорода [10].
Целью нашего исследования было экспериментальное изучение влияния гиперкальциемии, созданной введением витамина D, на функции почек, состояние перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы и некоторые показатели крови.
Материалы и методы исследований. Модель гиперкальциемии создавали на 30 крысах линии Вистар путем ежедневного, в течение 14 дней, введения им через зонд в желудок аптечного препарата «Аквадетрим» (Польша) в дозе 10 000 МЕ/100 г вместе с 1,5-2 мл водопроводной воды. Введение аквадетрима с таким количеством воды позволяет и полностью его ввести, и избежать гидратации, которая могла бы усилить вымывание препарата и уменьшить его влияние. Для корректного сопоставления полученных результатов контрольная группа из 15 крыс также получала эквивалентное количество водопроводной воды. При этом все животные на протяжении всего эксперимента имели свободный доступ к пище и воде, которая за 30-40 минут до начала опытов убиралась из клеток для предотвращения как обезвоживания, так и гипергидратации, то есть проводили исследования в условиях водного баланса. Световой режим соответствовал естественному.
Через семь дней введения аквадетрима ставили первые опыты, которые повторялись через неделю. Во время экспериментов животных помещали на шесть часов в специальные клетки для сбора мочи, в которой, а также в плазме крови, определяли содержание креатинина (метод Поппера) и мочевины (наборы фирмы «Лахема»), степень протеинурии и общего белка (методы Лоури и биуретовый), кальция (метод Radin, Gramza) и неорганического фосфора [3]. В крови также определяли количество эритроцитов и содержание гемоглобина с помощью гематологического анализатора фирмы Erma (Япония), а о перекисном окислении липидов судили по содержанию гидроперекисей в плазме крови и малонового диальдегида в эритроцитах, а об антиоксидантной защите - по активности каталазы и супероксиддисмутазы в эритроцитах [2]. С помощью формул рассчитывали часовой спонтанный диурез (мл/час/100 г), скорость клубочковой фильтрации (мл/час/100 г) и канальцевую реабсорбцию воды (%). Об объемной скорости почечного кровотока судили по результатам, полученным инвазивным способом на ультразвуковом флуометре Transonic НТ 313.
Полученные результаты статистически обрабатывались с применением параметрического метода сравнения средних величин, а степень достоверности оценивалась по t-критерию Стьюдента.
Полученные результаты. О гиперкальциемии можно говорить только при повышении в плазме крови содержания кальция, и его определение после недельного введения аквадетрима выявило достоверное (р<0,05) повышение с контрольной величины в 2,32±0,17 ммоль/л до 2,95±0,21 ммоль/л. Продолжение введения витамина D еще в течение одной недели повысило содержание кальция в плазме крови до 3,24±0,28 ммоль/л (р<0,002). То есть развивающаяся гиперкальциемия, очевидно, вызывала изменения исследуемых показателей.
Обмен кальция в организме человека и млекопитающих наиболее тесно связан с фосфором, и изменение одного из этих элементов непременно сказывается на другом, к тому же 85,0% соединений кальция костей приходится на долю его ортофосфорной соли. Повышение концентрации кальция в плазме крови после введения крысам аквадетрима сопровождалось увеличением содержания неорганического фосфора с 1,28±0,1 ммоль/л (контроль) до 1,69±0,12 ммоль/л (р<0,02) через одну неделю введения аквадетрима и 1,82±0,15 ммоль/л (р<0,01) при завершении двухнедельного эксперимента.
Одновременно с нарушением постоянства кальция в крови отмечалось повышение содержания конечного продукта креатин-фосфатной реакции, и являющегося важным показателем работы почек - креатинина, который у контрольных животных был 70,52±2,65 мкмоль/л, а после введения аквадетрима в течение одной недели стал 79,62±3,12 мкмоль/л (р<0,05), двух недель - повысился до 86,63±4,22 мкмоль/л (р<0,002).
В то же время гипервитаминоз D на конечный продукт метаболизма белка - мочевину, не оказал столь выраженного влияния, и недельное введение аквадетрима лишь незначительно повысило его содержание в плазме крови (4,85±0,39 ммоль/л - контроль, 5,49±0,42 ммоль/л - опыт), но после двух недель ежедневного введения витамина D отличие стало достоверным (6,95±0,53 ммоль/л, р<0,05).
Практически без изменений оставался уровень общего белка в плазме крови (62,46±2,18 г/л - контроль, 60,74±2,88 г/л - после недельного и 59,12±3,35 г/л - двухнедельного введения аквадетрима).
Недельное введение аквадетрима крысам оказало только активирующее влияние на количество эритроцитов в периферической крови (6,32±0,42·1012/л) и содержание гемоглобина (143,22±2,94 г/л), которые у контрольных крыс были 5,65±0,37·1012/л и 132,08±1,82 г/л. Достоверные же отличия эти показатели приобрели только после двухнедельного введения аквадетрима, когда концентрация эритроцитов в крови стала 7,25±0,5·1012/л (р<0,02), а содержание гемоглобина достигло уровня в 149,35±3,73 г/л (р<0,002). На то, что витамин D оказывает стимулирующее влияние на эритропоэз и его недостаточное поступление может способствовать развитию анемии, в литературе имеются ссылки [5; 7; 9], а повышение количества эритроцитов в периферической крови крыс только после двухнедельного введения аквадетрима, очевидно, можно объяснить тем, что на рост, созревание эритроцитов в красном костном мозге и их выход в периферическую кровь требуется пять дней, поэтому после недельных опытов только отмечалось стимулирующее влияние на эритропоэз.
Таким образом, ежедневное пероральное введение крысам линии Вистар аквадетрима в течение двух недель повышает в плазме крови содержание кальция и неорганического фосфора, креатинина и мочевины, в крови увеличивается количество эритроцитов и содержание гемоглобина, уровень общего белка в плазме крови не меняется.
На водовыделительную функцию почек введение аквадетрима оказало тормозящее влияние, и спонтанный диурез (табл. 1) у крыс после недельного приема витамина D снизился на 20,0% (р<0,05), а при завершении двухнедельных экспериментов еще на столько же (р<0,01). Изначально уменьшение количества выделяющейся мочи было обусловлено только усилением (р<0,02) обратного всасывания воды в канальцах почек, так как скорость клубочковой фильтрации увеличилась на 14,0% (табл. 1), но с продолжением введения аквадетрима к остающейся на прежнем повышенном уровне канальцевой реабсорбции воды присоединилось уменьшение на 25,4% скорости клубочковой фильтрации, что и усилило снижение спонтанного диуреза (табл. 1). То есть при двухнедельном введении крысам аквадетрима изменения обоих основных процессов мочеобразования способствовали уменьшению спонтанного диуреза.
Таблица 1
Спонтанный диурез, скорость клубочковой фильтрации, объем канальцевой реабсорбции воды и протеинурия у крыс при двухнедельном введении аквадетрима
Условия опытов |
Стат. показат. |
Диурез (мл/час/100 г) |
Клубочковая фильтрация (мл/час/100 г) |
Канальцевая реабсорбция (%) |
Протеинурия (мг/мл) |
Контроль |
M±m // n |
0,2±0,014 // n 14 |
13,76±1,15 |
98,51±0,08 |
0,076±0,006 // n 12 |
1 неделя |
M±m |
0,16±0,012 |
15,69±1,68 |
98,98±0,09 |
0,114±0,007 |
n // p |
14 // <0,05 |
>0,1 |
<0,02 |
12 // <0,05 |
|
2 неделя |
M±m |
0,12±0,009 |
10,26±0,64 |
98,87±0,1 |
0,145±0,011 |
n // p |
13 // <0,001 |
<0,02 |
<0,05 |
12 // <0,001 |
Отмеченное снижение скорости клубочковой фильтрации при завершении опытов, очевидно, было обусловлено уменьшением объемной скорости почечного кровотока, которая у контрольных крыс (n=7) была 11,48±0,72 мл/мин, а у экспериментальных (n=6) - 7,26±0,68 мл/мин (р<0,002), а при недельном введении аквадетрима особых изменений почечного кровотока (12,08±1,18 мл/мин, n=8) не отмечалось.
Несмотря на то что гипервитаминоз D не оказал влияние на содержание общего белка в плазме крови, однако в моче, как в конце первой, так и второй недели, определялась протеинурия, которая превышала величину контроля в 1,6 и в 2,1 раза соответственно (табл. 1).
При изучении влияния гиперкальциемии на пероксидацию липидов, о которой судили по содержанию в эритроцитах малонового диальдегида и гидроперекисей в плазме крови, было выявлено, что недельное введение аквадетрима способствовало достоверному повышению уровня гидроперекисей в 1,9 раза и малонового диальдегида в 1,6 раза, и при завершении экспериментов двухнедельного введения витамина D эти показатели еще больше увеличились - в 2,22 раза гидроперекиси и в 1,94 раза малонового диальдегида (табл. 2). То есть гиперкальциемия, создаваемая введением крысам витамина D, способствует развитию и усилению оксидативного стресса, и при этом прослеживается связь соразмерности изменений исследуемых показателей - в большей степени гидроперекисей, как первичных промежуточных липидных радикалов, по сравнению с малоновым диальдегидом, который относится ко вторичным продуктам пероксидации.
Таблица 2
Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у крыс при двухнедельном введении аквадетрима
Условия опытов |
Стат. показат. |
Гидроперекиси (мкмоль/л) |
Малоновый диальдегид (мкмоль/л) |
Каталаза (10-4 МЕ/1 г Hb) |
Супероксид-дисмутаза (ед. ингибир.) |
Контроль |
M±m // n |
4,12±0,29 // 12 |
28,96±1,56 // 13 |
6,88±0,29 // 11 |
68,84±2,49 // 10 |
1 неделя |
M±m |
7,89±0,41 |
47,05±3,24 |
5,64±0,37 |
80,16±3,55 |
n // p |
14 // <0,001 |
12 // <0,001 |
10 // <0,02 |
9 // <0,02 |
|
2 неделя |
M±m |
9,16±0,38 |
56,28±4,12 |
5,12±0,42 |
85,73±4,56 |
n // p |
12 // <0,001 |
13 // <0,001 |
11 // <0,002 |
12 // <0,01 |
Изменение перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот сопровождалось нарушением активности ферментов антиоксидантной защиты, особенно ферментов, составляющих первую линии защиты - супероксиддисмутазы и каталазы. Так, активность супероксиддисмутазы, способной к инактивации радикалов кислорода, возникающих в ходе биологических реакций переноса электронов, после недельного введения крысам аквадетрима достоверно (р<0,05) снизилась, и с усилением гипервитаминоза D продолжала слабеть (р<0,002) (табл. 2). Снижение активности этого фермента, чей каталитический цикл включает восстановление и окисление иона металла на его активном центре и имеет три формы (содержащий медь в цитозоле, цинк в эндотелии и марганец в матриксе митохондрий), может быть обусловлено тем, что кальций, а тем более повышенное его содержание, оказывает конкурирующее действие с цинком на уровне всасывания в кишечнике [6].
Аналогично супероксиддисмутазе снижалась активность другого фермента антиоксидантной защиты, способного восстанавливать перекись водорода до воды, максимальная концентрация которой обнаружена в эритроцитах - каталазы [4]. Активность каталазы по мере введения аквадетрима уменьшалась до значений, имеющих достоверное отличие как в конце первой (р<0,02), так и второй (р<0,002) недели (табл. 2).
Таким образом, ежедневное, в течение двух недель, введение половозрелым крысам линии Вистар водного раствора витамина D «Аквадетрим» в дозе 10 000 МЕ/100 г повышает в крови содержание кальция и неорганического фосфора, креатинина и мочевины, количество эритроцитов и гемоглобина, уровень общего белка в плазме крови не меняется, усиливает пероксидацию липидов (повышение гидроперекисей и малонового диальдегида) и ослабляет антиоксидантную защиту (снижение активности супероксиддисмутазы и каталазы). Недельное введение аквадетрима уменьшает спонтанный диурез за счет усиления канальцевой реабсорбции воды, а двухнедельный гипервитаминоз - еще и за счет одновременного снижения скорости клубочковой фильтрации.
Рецензенты:
Бибаева Л.В., д.м.н., профессор, проректор по НИР и заведующая кафедрой биологии и гистологии Северо-Осетинской государственной медицинской академии, г. Владикавказ.
Урумова Л.Т., д.м.н., доцент кафедры патологической физиологии Северо-Осетинской государственной медицинской академии, г. Владикавказ.