Введение
Недостаточность защитных механизмов организма приводит к появлению различных заболеваний, особенно у молодняка в первые месяцы жизни [14, 23, 26]. Эти обстоятельства настоятельно требуют применения эффективных средств, направленных на повышение резистентности организма животных. Определение уровня естественных защитных сил животных и широкое использование их показателей в селекционной работе дает возможность создавать в хозяйствах высокорезистентные стада, обеспечивающие высокий уровень продуктивности [6].
В связи со сложной радиоэкологической ситуацией, на территории России и в сопредельных странах несомненную актуальность приобретают исследования эффектов хронического облучения в малых дозах. В условиях хронического облучения имеет место сложная перестройка в системе гемопоэза с вовлечением разнообразных механизмов адаптации [2]. Полагают, что биологические эффекты низкоинтенсивного облучения в малых дозах индуцируются преимущественно опосредовано через системы регуляции, иммунного ответа и антиоксидантного статуса организма, а также путем дестабилизации генома [3, 16, 17]. При содержании животных на территориях с повышенной плотностью загрязнения 137Cs создаются условия хронического радиационного воздействия. К таким территориям относят площади с плотностью загрязнения этим радионуклидом более 1 Ku/км2 (37 кБк/м2) [4]. Установлено, что при радиационном облучении животных на слизистой оболочке и в полости толстого и тонкого кишечника резко снижается число бифидобактерий, лактобактерий и одновременно увеличивается количество условно-патогенных бактерий. Назначение при этом лактобактерий и бифидобактерий нормализует микрофлору кишечника [24]. Пробиотики укрепляют эпителиальный барьер благодаря стимуляции иммунных клеток подслизистого слоя кишечника, предотвращая таким образом перемещение патогенных микроорганизмов через эпителий кишечника [19, 25]. При применении пробиотиков наблюдается повышение жизнеспособности и резистентности, лучшее усвоение питательных веществ корма и более интенсивный рост животных [31, 13]. Микроорганизмы, входящие в состав пробиотиков, активизируют Т- и В- системы иммунитета, влияют на выработку иммуноглобулина А, обусловливающего местный иммунитет слизистой оболочки кишечника [25]. Отмечено повышение фагоцитарной активности макрофагов и нейтрофилов под воздействием различных видов лактобацилл и бифидобактерий, в т.ч. L. acidophilus, L. casei, В.longum, B. bifidum и др. [5].
До сих пор остаются нерешенными вопросы хронического влияния малых доз радиации на животных в удалении от Чернобыльской АЭС на 150-300 км (Брянская область) [1].
Целью наших исследований было изучение влияния комплексного пробиотического препарата лактобацилл на естественную резистентность телят, содержащихся в хозяйстве с повышенной плотностью загрязнения почвы радиоцезием.
Материал и методика исследований
Для проведения опыта в СПК «Родина» Красногорского района Брянской области на МТФ в с. Макаричи были сформированы по методу пар-аналогов 2 группы телят черно-пестрой породы 5-недельного возраста (±2 суток) со средней живой массой 49,53±1,44 кг. Животные 1 группы (5 голов) были контрольными, телята 2 группы (10 голов) - опытными и получали с молоком один раз в сутки лиофилизированный препарат молочнокислых бактерий по 1 г/гол. (2,2۰1010 КОЕ/г) с 5-недельного возраста в течение 21 суток. Телята содержались в соответствующих ветеринарно-зоогигиеническим требованиям условиях, получали молозиво, а затем молоко и другие корма, в соответствии с общепринятыми нормами [18].
В СПК «Родина» Красногорского района плотность загрязнения пашни 137Cs в 1987 (1990) г. составляла 11,74±0,65 Ku/км2 (434,52±24,08 кБк/м2), а пастбищ - 12,98±1,54 Ku/км2 (461,76±61,03 кБк/м2). В 2008 году плотность загрязнения почвы 137Cs в СПК «Родина» Красногорского района существенно снизилась и составляла: пашни - 4,01±0,21 Ku/км2 (144,75±7,98 кБк/м2), а пастбищ - 8,71±1,07 Ku/км2 (330,97±39,28 кБк/м2) (по данным Центра химизации и сельскохозяйственной радиологии «Брянский» ФГБУ «Брянскагрохимрадиология»).
Активность 137Cs в кормах СПК «Родина» в 2011году составляла: в концентратах - 12,50±1,32 Бк/кг; в сене - 91,92±11,48 Бк/кг; в траве - 106,26±16,53 Бк/кг; в молоке - 38,40±4,46 Бк/кг (по данным ФГБУ «Брянская межобластная ветеринарная лаборатория»).
Перед началом опыта, после окончания выпаивания препарата и через 1 месяц после окончания выпаивания препарата у 5 животных из каждой группы утром до кормления брали пробы крови из яремной вены для анализов. Количество лейкоцитов и эритроцитов в крови подсчитывали в камере Горяева, гемоглобин определяли гемиглобинцианидным методом, гематокрит - в гематокритной центрифуге [9]. Фагоцитарный показатель (ФП, %) рассчитывали как процент нейтрофилов, способных к поглощению частиц латекса, фагоцитарный индекс (ФИ, у.е.) - среднее число частиц латекса, поглощенных одним активным нейтрофилом, абсолютный фагоцитоз крови (АФ, 109/л) - общее количество частиц латекса, поглощаемое нейтрофилами в литре крови, фагоцитарное число (ФЧ, у.е.) - среднее количество частиц латекса, приходящееся на один нейтрофил (как активный, так и не активный) [27].
Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по результатам реакции восстановления нитросинего тетразолия в НСТ-позитивных нейтрофилах (+НСТ, %) [28, 29]. Индекс активации нейтрофилов (ИАН) вычисляли согласно инструкции «Реокомплекс» по использованию НСТ-тест набора. Поглотительную способность нейтрофилов (ФП, %, ФИ, у.е., АФ, 109/л) и активность их оксидазных систем (+НСТ, %, ИАН) оценивали в двух состояниях: базальном (баз.) - в свежевзятой крови стабилизированной гепарином, и стимулированном (стим.) - после внесения в пробы крови зимозана, что моделирует условия бактериального заражения и характеризует адаптационные резервы поглотительной и микробицидной способности нейтрофильных гранулоцитов [27]. Показатель резерва оксидазной способности нейтрофилов периферической крови (ПР) и коэффициент их метаболической активации (К) рассчитывали по И.А. Пахмутову, М.С. Ульяновой [20]. Кислородонезависимую микробицидность нейтрофилов периферической крови оценивали по содержанию в них катионных белков по методу В.И. Жибинова [7], рассчитывая средний цитохимический коэффициент (СЦК) по формуле, предложенной Н.А. Макаревичем [12].
Полученные цифровые данные обработаны методом вариационной статистики. Для выявления статистически значимых различий использован критерий Стьюдента по Н.А. Плохинскому [22]. Достоверно значимыми изменения считали при р<0,05. В качестве значений физиологической нормы принимали интервалы соответствующих показателей, приведенные в литературе [9, 28].
Результаты исследований
Анализ полученных результатов показал, что содержание лейкоцитов в крови у подопытных телят перед началом опыта и через 21 сутки выпаивания препарата соответствовало нормативным значениям без существенных межгрупповых различий (табл. 1). Через месяц после окончания выпаивания препарата молочнокислых бактерий произошло достоверное увеличение содержания лейкоцитов в крови телят, получавших пробиотик, как по сравнению с предыдущим периодом исследования (на 76,76%), так и по отношению к количеству этих клеток в крови у контрольных телят (на 67,51%), что указывает на повышение активности защитных механизмов организма телят под воздействием пробиотика. Сумма нейтрофилов всех ядерных форм за весь период исследования находилась в пределах нижних границ физиологической нормы.
У телят опытной группы через месяц после окончания выпаивания препарата отмечено достоверное увеличение ФП в базальных условиях по сравнению с предыдущим периодом на 117,30 %. У телят контрольной группы через 30 суток после окончания опыта произошло достоверно значимое увеличение ФП в базальных условиях как по отношению к предыдущему периоду (на 588,29 %), так и по отношению к телятам опытной группы (на 207,74 %), что указывает на наличие в их организме факторов, активирующих поглотительную способность нейтрофилов крови и на благополучное состояние организма у телят, получавших препарат [15, 21]. После внесения в пробы крови телят подопытных групп зимозана значения фагоцитарного показателя незначительно превышали базальный уровень. Через 21 сутки выпаивания препарата ФП у животных 1 группы после стимуляции проб крови зимозаном существенно не изменился и был ниже как нормативных значений, так и по отношению к первоначальному периоду (на 14,65 %), а также по сравнению с животными опытной группы (на 17,66 %), что, по мнению А.Н. Маянского, свидетельствует о частичной дезактивации этих клеток и снижении резистентности [15]. ФП в стимулированных зимозаном условиях перед началом опыта был значительно ниже нормативных значений и через 21 сутки опытного периода существенно не изменялся. Однако в связи с низким ФП в базальных условиях у телят 1 и 2 групп через 21 сутки опытного периода ФП в условиях стимуляции нейтрофилов крови зимозаном был достоверно выше (на 356,10 % и 437,91 % соответственно) по сравнению с базальными условиями, что указывает на появление адаптационного резерва поглотительной способности нейтрофилов. Через месяц после окончания выпаивания пробиотика ФП в стимулированных зимозаном условиях повышался и был выше у телят контрольной группы на 22,96%, а у телят опытной группы - на 246,24 % (р<0,05) по сравнению с базальным уровнем. Следовательно, применение пробиотика обусловило повышение адаптационного резерва числа нейтрофилов крови, способных к поглощению чужеродного материала, на что указывает достоверно более высокий ФП (на 246,24%) в стимулированных зимозаном условиях у телят опытной группы, по сравнению с базальными условиями, через месяц после окончания выпаивания препарата.
Существенных изменений интенсивности поглощения частиц латекса нейтрофилами крови в базальных условиях под действием пробиотика за весь опытный период не установлено.
Таблица 1. Поглотительная способность нейтрофилов крови подопытных телят.
|
Показатели |
Перед началом опыта (5 недель) n=5 |
Группы |
Через 21 сутки опыта (8 недель) |
Через месяц после окончания выпаивания препарата(12 недель) |
|
Лейкоциты, 109/л |
4,55 ± 0,73 |
1,n=5 |
6,02 ± 0,29 |
5,54 ± 0,23 |
|
2,n=5 |
5,25 ± 1,45 |
9,28 ± 1,69 |
||
|
Сумма нейтрофилов,109/л |
1,57 ± 0,29 |
1,n=5 |
1,41 ± 0,22 |
0,92 ± 0,16 |
|
2,n=5 |
1,69 ± 0,80 |
1,71 ± 0,61 |
||
|
ФП баз., %
|
9,34 ± 1,26 |
1,n=5 |
4,10 ± 0,38∆ |
28,22± 2,51∆□ |
|
2,n=5 |
4,22 ± 0,58∆ |
9,17 ± 0,88□* |
||
|
ФП стим., %
|
21,91 ± 2,52 |
1,n=5 |
18,70 ± 3,47 |
34,70± 2,84∆□ |
|
2,n=5 |
22,70 ± 6,9 |
31,75 ± 3,22 |
||
|
ФИ баз., у.е
|
5,82 ± 0,42 |
1,n=5 |
6,97 ± 0,79 |
7,44 ± 0,30∆ |
|
2,n=5 |
8,15 ± 0,69∆ |
8,01 ± 0,49∆ |
||
|
ФИ стим., у.е
|
4,52 ± 0,34 |
1,n=5 |
5,17 ± 0,45 |
6,44 ± 0,25∆ |
|
2,n=5 |
5,50 ± 0,36 |
6,61 ± 0,29∆ |
||
|
АФ баз., 109/л
|
0,88 ± 0,23 |
1,n=5 |
0,39 ± 0,07 |
1,85 ± 0,12∆□ |
|
2,n=5 |
0,53 ± 0,24 |
2,46 ± 0,73 |
||
|
АФ стим., 109/л |
1,42 ± 0,10 |
1,n=5 |
1,34 ± 0,35 |
2,01 ± 0,29 |
|
2,n=5 |
1,70 ± 0,63 |
3,53 ± 1,15 |
||
|
ФЧ баз., у.е. |
0,52 ± 0,05 |
1,n=5 |
0,28 ± 0,03∆ |
2,15 ± 0,21∆□ |
|
2,n=5 |
0,31 ± 0,04∆ |
1,50 ± 0,15∆□ |
||
|
ФЧ стим., у.е. |
1,03 ± 0,19 |
1,n=5 |
1,00 ± 0,22 |
2,23 ± 0,19∆□ |
|
2,n=5 |
1,25 ± 0,40 |
1,99 ± 0,34 |
Примечание: * - р<0,05 по отношению к контрольной группе, ∆ - р<0,05 по отношению к первоначальному периоду,□ - р<0,05 по отношению к предыдущему периоду.
Фагоцитарный индекс в стимулированных зимозаном условиях у телят подопытных групп во все периоды исследования существенно не отличался от величины этого показателя в базальных условиях и был ниже нормативных значений, что говорит об отсутствии адаптационного резерва интенсивности поглощения чужеродного материала нейтрофильными гранулоцитами. Это указывает на экстенсивный путь защиты, только за счет повышения числа активных нейтрофилов в крови у животных через месяц после окончания выпаивания препарата.
Величина абсолютного фагоцитоза в базальных условиях перед началом опыта и через 21 сутки опытного периода у животных обеих групп соответствовала наименьшим нормативным значениям без существенных межгрупповых различий. При этом через месяц после окончания выпаивания препарата молочнокислых бактерий наблюдалось достоверно значимое увеличение АФ в базальных условиях у телят контрольной группы, как по сравнению с первоначальным периодом (на 110,23 %), так и по сравнению с предыдущим периодом (на 374,36 %). У телят опытной группы достоверные изменения отсутствовали. В индуцированных зимозаном условиях величина этого показателя существенно не изменялась у животных всех подопытных групп и была ниже физиологически нормальных значений. Через месяц после окончания выпаивания препарата молочнокислых бактерий отмечена тенденция к увеличению АФ в стимулированных зимозаном условиях у телят опытной группы (на 107,65 %), как по сравнению с предыдущим периодом, так и (на 75,62 %) по сравнению с контрольными животными, что указывает на наличие адаптационного резерва числа нейтрофилов крови, способных к поглощению чужеродного материала у телят опытной группы.
Фагоцитарное число в базальных условиях у животных 1 и 2 групп через 21 сутки опытного периода было достоверно ниже, по сравнению с началом опыта (на 46,15 % и на 40,39 % соответственно). Это указывает на отсутствие необходимости активации нейтрофилов крови и, соответственно, благополучное состояние организма животных в этот период. Через месяц после окончания опыта наблюдалось достоверное увеличение этого показателя у телят контрольной группы, как по сравнению с началом опыта (на 313,46 %) так и по сравнению с 21-суточным возрастом (на 667,86 %). ФЧ в базальных условиях через месяц после окончания выпаивания пробиотика у телят опытной группы по сравнению с началом опыта достоверно увеличилось на 188,46 % и по сравнению с предыдущим периодом исследования - на 383,87 %. При этом ФЧ в базальных условиях у телят опытной группы было ниже на 30,23 %, чем у телят контрольной группы, что свидетельствует о более благополучном состоянии их организма. Фагоцитарное число в стимулированных зимозаном условиях значительно не различалось у телят обеих групп во все периоды исследования и незначительно превышало значения этого показателя в базальных условиях, не достигая нормативных значений.
Анализ данных, характеризующих кислородозависимую микробицидность нейтрофилов крови (Табл.2), показал, что через месяц после окончания опыта произошло достоверно значимое увеличение относительного количества НСТ- позитивных нейтрофилов у телят опытной группы (на 126,00 %) по сравнению с предыдущим периодом. Это указывает на повышение реактивности оксидазных систем микробицидности под влиянием пробиотика.
Содержание НСТ-позитивных нейтрофилов крови в индуцированных зимозаном условиях у подопытных телят перед началом опыта было достоверно выше, чем в базальных условиях на 765,79% но ниже нормативных значений. Через 21 сутки опытного периода уровень НСТ-позитивных нейтрофилов крови в стимулированных зимозаном условиях у животных обеих групп существенно не различался и был ниже нормативных значений с тенденцией к более высоким значениям у телят контрольной группы на 16,90 % (р>0,05) по сравнению с опытной, при этом достоверно превосходил значения этого показателя в базальных условиях у телят контрольной группы на 435,48 % и на 1320 % у телят опытной группы, что указывает на наличие адаптационного резерва НСТ-позитивных нейтрофилов крови телят. При этом относительное количество этих клеток не достигало нормативных значений характерных для телят этого возраста (50,6±4,3 %) [6].
Таблица 2. Микробицидная активность нейтрофилов крови подопытных телят
|
Показатели |
Перед началом опыта (n=5) |
Группы |
Через 21 сутки опыта (8 недель) |
Через месяц после окончания выпаивания препарата(12 недель) |
|
+НСТ баз., % |
1,14±0,27 |
1, n=5 |
3,10±0,87 |
2,40±0,51 |
|
2, n=5 |
1,00±0,00 |
2,26±0,37□ |
||
|
+НСТ стим., % |
9,87±1,46 |
1, n=5 |
16,6±2,87 |
8,10±1,00□ |
|
2, n=5 |
14,20±2,11 |
5,60±1,17□ |
||
|
ИАН баз. |
0,01±0,00 |
1, n=5 |
0,04±0,01∆ |
0,03±0,01 |
|
2, n=5 |
0,01±0,00* |
0,02±0,01 |
||
|
ИАН стим. |
0,12±0,02 |
1, n=5 |
0,19±0,04 |
0,10±0,02 |
|
2, n=5 |
0,16±0,03 |
0,09±0,02 |
||
|
К |
0,87±0,03 |
1, n=5 |
0,79±0,07 |
0,66±0,10 |
|
2, n=5 |
0,92±0,01 |
0,66±0,09□ |
||
|
ПР |
13,45±6,51 |
1, n=5 |
7,38±2,34 |
4,38±1,27 |
|
2, n=5 |
14,20±2,11 |
3,72±0,86□ |
||
|
СЦК |
1,39±0,02 |
1, n=5 |
1,40±0,03 |
1,22±0,04∆□ |
|
2, n=5 |
1,34±0,06 |
1,30±0,01∆ |
Примечание: * - р<0,05 по отношению к контрольной группе, ∆ - р<0,05 по отношению к первоначальному периоду,□ - р<0,05 по отношению к предыдущему периоду.
Через месяц после окончания выпаивания препарата у телят 1 и 2 групп отмечено достоверно значимое уменьшение относительного количества НСТ-позитивных нейтрофилов крови в стимулированных зимозаном условиях на 51,20 % и 60,56 % соответственно. При этом количество НСТ- позитивных нейтрофилов в стимулированных зимозаном условиях было выше, чем в базальных условиях на 237,50 % и 147,79 % у телят 1 и 2 групп соответственно, что указывает на наличие адаптационного резерва НСТ-позитивных нейтрофилов крови телят в этот период.
Индекс активации нейтрофилов крови в базальных условиях перед началом опыта был ниже нормативных значений и существенно не изменялся на протяжении опытного периода у животных обеих групп. После внесения в пробы крови зимозана у животных перед началом опыта индекс активации нейтрофилов крови был гораздо выше (в 12 раз), чем в базальных условиях, что свидетельствует о наличии адаптационного резерва этого защитного механизма. Через месяц после окончания выпаивания препарата индекс активации нейтрофилов крови (после стимуляции зимозаном) у телят обеих групп существенно не различался и был ниже нормативных значений. При этом у телят 1 и 2 групп значения этого показателя было выше, чем в базальных условиях на 233,33 % и 350,00 % (р<0,05) соответственно. Следовательно, у телят всех подопытных групп в оба периода исследования имелся адаптационный резерв кислородозависимой микробицидности нейтрофилов крови, в большей степени обусловленный повышением активности оксидазных систем этих клеток (интенсивный путь повышения активности), однако уровень активности кислородозависимых систем нейтрофилов в стимулированных условиях в изученные периоды был ниже нормативных значений.
Скармливание пробиотика «Тетралактобактерин» не оказало существенного влияния на коэффициент метаболической активности кислородозависимых механизмов микробицидности (К), показатель резерва кислородозависимой микробицидности (ПР) и кислородонезависимая микробицидность нейтрофилов крови.
Заключение
Установлено, что у телят, содержавшихся в хозяйстве с повышенной плотностью загрязнения почвы 137Cs, снижена активность защитных механизмов по сравнению с аналогичными животными в чистой зоне. На это указывает более низкое содержание в крови лейкоцитов (на 46,22%, р<0,05) у животных в загрязненной зоне, по сравнению с телятами в чистой зоне [10]. Имеются данные, что в условиях хронического облучения имеет место сложная перестройка в системе гемопоэза с вовлечением разнообразных механизмов адаптации [2]. Снижение активности защитных механизмов организма у телят в загрязненной зоне обусловлено, главным образом, низким уровнем естественной резистентности и, в частности, недостаточностью фагоцитарной функции нейтрофилов, на что указывает более низкий (на 80,50%) ФП в базальных и (на 55,92%) в стимулированных зимозаном условиях, АФ (на 88,95%) в базальных условиях и (на 82,12%) в стимулированных зимозаном, число нейтрофилов крови, обладающих кислородозависимой микробицидностью, как в базальных (на 77,20%), так и в стимулированных условиях (на 64,62%). В ряде работ показано снижение митохондриального дыхания и окислительного фосфорилирования в клетках различных облученных организмов [11, 32]. Индекс активации нейтрофилов в базальных условиях у телят в загрязненном хозяйстве был ниже на 80,00 %(р<0,05). Имеются сведения, что это может быть связано с нарушением структуры мембран клетки [8].
Кислородонезависимая микробицидность нейтрофилов крови у телят в загрязненной зоне была выше на 40,40 % (р<0,05). Возможно, это своего рода компенсаторная реакция организма на более низкую активность механизмов кислородозависимой микробицидности
Ежедневное выпаивание телятам с 5-недельного возраста в течение 21 суток пробиотика «Тетралактобактерин» в дозе 1 г/гол способствовало повышению адаптационного резерва числа нейтрофилов крови, способных к поглощению чужеродного материала, на что указывает достоверное увеличение фагоцитарного показателя (на 246,24%) через месяц после окончания выпаивания пробиотика в условиях стимуляции нейтрофилов крови зимозаном по сравнению с базальным уровнем, более благополучному состоянию организма телят, на что указывает на 75,00 % (р<0,05) более низкий индекс активации нейтрофилов крови в базальных условиях через 21 сутки опытного периода и более низкий фагоцитарный показатель в базальных условиях (на 67,51 % (р<0,05)) через месяц после окончания выпаивания препарата.
Рецензенты:
Яковлева С.Е., д.б.н., профессор, зав. кафедрой частной зоотехнии ФГБОУ ВПО «Брянская государственная сельскохозяйственная академия», Брянская область, п. Кокино.
Зайцева Е.В., д.б.н., профессор, заместитель директора естественно-научного института, заведующая кафедрой зоологии и анатомии, ФГБОУ ВПО «Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского», г. Брянск.