Введение
Важной проблемой современной медицины являются патологические состояния, возникающие в результате отрицательного влияния лекарств. Как пример лекарственного препарата, который при передозировке проявляет выраженное токсическое действие, можно привести парацетамол (ацетаминофен, N-ацетил-пара-аминофенол), являющийся активным метаболитом фенацетина с химически близкими к нему свойствами [9; 10]. На фармацевтическом рынке Украины в данное время наблюдается увеличение ассортимента препаратов парацетамола (более 50 названий) как отечественного, так и зарубежного производства, характеризующихся разнообразием лекарственных форм - от таблеток и суппозиториев до фруктовых детских сиропов, что делает его удобным для применения для пациентов всех возрастных групп. Популярность парацетамола значительно возрастает, и это связано с распространенным мнением о том, что он является наиболее безопасным из всех так называемых малых анальгетиков [2]. В терапевтических дозах парацетамол имеет относительно небольшую токсичность, однако сознательное, а зачастую неконтролируемое употребление высоких доз препарата может привести к возникновению тяжелых осложнений. По данным медицинских центров США и Великобритании, передозировка ацетаминофена является главной причиной острой печеночной недостаточности [9; 11]. Поражение печени парацетамолом часто принимает форму фульминантной печеночной недостаточности и нередко заканчивается смертью больных [9]. Токсические эффекты ацетаминофена тесно ассоциированы с особенностями его биотрансформации с участием ферментов эндоплазматического ретикулума печени - в частности, с образованием высокоактивного интермедиата N-ацетил-пара-бензохинонимина, супероксидного радикала [10; 14], а также способностью ацетаминофена и его токсичного метаболита стимулировать клетки Купфера, являющиеся продуцентами оксида азота, чрезмерные количества которого проявляют мощное повреждающее действие
Гепатотоксичность ацетаминофена в значительной степени зависит от возраста. В частности, новорожденные и молодые крысы могут проявлять как относительную устойчивость к некрозогенному влиянию препарата вследствие низкой активности цитохрома Р-450, так и повышенную чувствительность из-за недостаточных ресурсов глутатиона [8]. Для детей и взрослых терапевтические интервалы и токсический потенциал ацетаминофена также разные [2].
Целью нашей работы было исследование влияния ацетаминофена на процессы микросомального окисления у крыс разных возрастных периодов.
Материал и методы исследования
Опыты проведены на 102 половозрелых крысах-самцах трех возрастных периодов: неполовозрелые (молодые) - в возрасте 3 месяца, половозрелые (взрослые, 6-8-месячные) и старые - 18-24-месячные, содержавшихся на стандартном рационе вивария ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет имени И.Я. Горбачевского». Животные были разделены на 2 группы: 1-я группа - интактные животные, которым вводили растворитель (2%-ный раствор крахмала); 2-я группа - животные с острым поражением ацетаминофеном, который вводили внутрижелудочно в дозе 1250 мг / кг (0,5 LD50) в виде суспензии в 2%-ном растворе крахмального геля 1 раз в сутки в течение 2 суток. Использовали субстанцию ацетаминофена производства Huzhou Beigang Enterprises Group Corp. Эвтаназию животных производили методом декапитации в условиях тиопентал-натриевого наркоза на первые, третьи и пятые сутки от последнего введения ацетаминофена. Все манипуляции с экспериментальными животными проводили в соответствии с «Правилами выполнения работ с использованием экспериментальных животных» [3; 6]. В полученных методом дифференциального центрифугирования микросомах гепатоцитов [7; 12] определяли концентрацию цитохромов Р-450 и b5 [1] на сектрофотометре Lambda 25 UV (Pelkin-Elmer, США), а также N-деметилазную активность по количеству образованного формальдегида в реакции деметилирования диметиланилина (DMA) и пара-гидроксилазную активность по количеству образованного пара-аминофенола [4]. По эффекту бокового положения определяли также длительность гексеналового сна - интегрального показателя, характеризующего детоксикационную способность микросом печени.
Полученный в результате экспериментов цифровой материал обрабатывали с помощью методов вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента [5]. Разницу между исследуемыми группами считали достоверной при р < 0,05 .
Результаты исследования и их обсуждение
Как видно из данных, приведенных в табл. 1, существует достоверная разница показателей функционирования окислительных систем микросом печени здоровых крыс в зависимости от возраста. Концентрация цитохрома Р-450 и активность окислительных процессов у интактных животных разных возрастных периодов отличаются. Так, у 3-месячных животных содержание металлопротеинов достоверно превышало аналогичный показатель взрослых и старых соответственно в 2,2 и 2,4 раза, а цитохрома b5 - в 1,5 и 2,2 раза. Более высокой у животных данной возрастной категории была также скорость N-деметилирования димеиланилина и гидроксилирования анилина. Эти данные свидетельствуют о значительных возрастных особенностях функционирования детоксикационной системы микросом печени. Старые животные характеризуются низкой функциональной активностью печеночных микросомальных монооксигеназ.
Введение ацетаминофена вызывало выраженное угнетение окислительной способности микросомальных ферментов в гепатоцитах животных всех возрастных периодов, однако наблюдались значительные возрастные различия. Наиболее выраженные в процентном отношении изменения через 24 ч после введения ацетаминофена наблюдались у 3-месячных животных. Так, концентрация цитохрома Р450 снизилась у них на 45,8%, b5 - на 46,6%, N - деметилазная и пара-гидроксилазная активность соответственно на 40,5 и 33,7%, что достоверно отличается от показателей интактных животных. Менее выраженные отклонения наблюдались у взрослых крыс. Концентрация цитохрома Р-450 у них снизилась до 59,4% , b5 - до 63,8%. Меньшим изменениям подвергались и процессы окисления. N-деметилазная активность снизилась до 68,6%, п-гидроксилазная - до 74,6%. В старых животных изменения были наименее выражены. Концентрация цитохрома Р-450 в них составляла 65,1% , а b5 - 67,1% по сравнению со здоровыми, активность деметилирования DMA - 68,9%, а гидроксилирования анилина - 75,8%. На третьи сутки после введения ацетаминофена в микросомах печени молодых животных показатели были почти на уровне первых суток, за исключением р-гидроксилазной активности, которая выросла и составила 82,6% от интактных. У взрослых животных наблюдался рост исследуемых показателей. Это особенно касается скорости окисления субстратов: N-деметилазная активность возросла до 90,9%, а п-гидроксилазная - до 86,6%. У животных 18-24-месячного возраста нами зафиксировано лишь незначительное повышение активности микросомальных ферментов по сравнению с первыми сутками. До 5-х суток картина несколько изменилась. У взрослых животных исследуемые нами показатели значительно улучшались и приближались к уровню интактных, в меньшей степени восстанавливались показатели молодых, а наименьшую тенденцию к нормализации проявляли ферменты микросом старых животных.
Таблица 1
Показатели ферментной активности микросом печени крыс разного возраста, пораженных ацетаминофеном (М±m)
|
Группа животных |
Возраст |
Показатель |
|||||||||||
|
Цитохром Р-450, ммоль/кг |
Цитохром b5, ммоль/кг |
N-деметилазная активность, ммоль/кг·мин |
Пара-гидроксилазная активность, ммоль/кг·мин |
||||||||||
|
Интактные |
Молодые, n=10 |
1,53±0,13* |
0,86±0,14* |
12,57±0,78* |
0,92±0,04* |
||||||||
|
Взрослые, n=10 |
0,69±0,06 |
0,58±0,08 |
8,15±0,24 |
0,75±0,02 |
|||||||||
|
Старые, n=10 |
0,63±0,05 |
0,49±0,04 |
7,64±0,22 |
0,69±0,02 |
|||||||||
|
Ацетаминофен |
|
24 ч |
3-и сутки |
5-е сутки |
24 ч |
3-и сутки |
5-е сутки |
24 ч |
3-и сутки |
5-е сутки |
24 год |
3-и сутки |
5-е сутки |
|
Молодые, n=8 |
0,83± 0,04** |
0,85± 0,07** |
1,11± 0,05** |
0,46± 0,07** |
0,49± 0,04** |
0,59± 0,05** |
7,48± 0,13** |
8,39± 0,23** |
9,04± 0,15** |
0,61± 0,02* |
0,76± 0,03** |
0,80± 0,05 |
|
|
Взрослые, n=8 |
0,41± 0,05** |
0,46± 0,06** |
0,60± 0,04 |
0,37± 0,02** |
0,39± 0,02** |
0,48± 0,04 |
5,59± 0,22** |
7,41± 0,15** |
7,54± 0,19 |
0,56± 0,01** |
0,65± 0,04** |
0,69± 0,05 |
|
|
Старые, n=8 |
0,41± 0,04** |
0,43± 0,03** |
0,49± 0,03** |
0,28± 0,03** |
0,29± 0,03** |
0,32± 0,04** |
5,26± 0,41** |
5,65± 0,17** |
5,83± 0,15** |
0,52± 0,02** |
0,56± 0,03** |
0,58± 0,02** |
|
Примечания здесь и в таблице 2:
* - разница достоверна по сравнению с взрослыми для интактных животных;
** - разница пораженных ацетаминофеном достоверна по сравнению с интактными животными соответствующих возрастных периодов
С целью интегральной оценки окислительной способности микросомальных монооксигеназ мы исследовали продолжительность гексеналового сна. Из результатов, представленных в табл. 2, видно, что с возрастом этот показатель значительно возрастает, и у взрослых и старых животных он достоверно выше, чем у молодых. Введение ацетаминофена наиболее интенсивно повышает продолжительность гексеналового сна у молодых животных. На 1-е сутки она превышала показатель интактных животных в 2,1 раза, на 3-и и 5-е соответственно в 1,9 и 1,6 раза. Продолжительность сна у взрослых и старых животных через 24 часа от момента введения ацетаминофена возросли на 56%, однако в дальнейшем показатель половозрелых животных снижался и составил соответственно 149,1 и 104,2%, тогда как у старых крыс снижение было менее выражено (соответственно 155,3 и 126,6% от уровня здоровых).
Таблица 2
Длительность гексеналового сна у животных разных возрастных периодов с токсическим поражением ацетаминофеном (M±m)
|
Возрастной период |
Группа животных |
|||
|
Интактные, n=10 |
Пораженные ацетаминофеном |
|||
|
24 часа, n=8 |
3-и сутки, n=8 |
5-е сутки, n=8 |
||
|
Молодые |
18,9±0,5* |
38,6±1,2** |
36,4±1,4** |
30,4±2,2** |
|
Взрослые |
28,7±1,4 |
44,9±1,8** |
42,8±1,6** |
29,9±1,3 |
|
Старые |
31,6±1,5 |
49,4±1,2** |
49,1±1,7** |
39,7±1,2** |
Выводы
Таким образом, ацетаминофен проявляет наиболее выраженное ингибирующее влияние на окислительные процессы в микросомах печени молодых животных, что, вероятно, является следствием высокой активности в них электронтранспортных цепей, участвующих в метаболической активации ацетаминофена. Медленная нормализация показателей у старых животных может быть следствием преобладания у них ковалентного связывания с цитохромом Р-450, что приводит к необратимому его ингибированию, а также снижением белоксинтетических процессов вследствие токсического влияния на хромосомный аппарат гепатоцитов.
Рецензенты:
Корда М.М., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой медицинской биохимии ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского», г. Тернополь.
Посохова Е.А., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фармакологии с клинической фармакологией ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского», г. Тернополь.