Введение
В настоящее время в практической медицине широко используется воздействие различных физических факторов для лечения ряда заболеваний. Однако биологические механизмы их лечебного влияния остаются малоисследованными. Ранее было показано образование активных форм кислорода (АФК) в водных растворах под действием тепла [6]. Поскольку АФК выполняют сигнально-регуляторную роль в биологических процессах [9], их образование может быть важным фактором лечебного воздействия и адаптации организма к влиянию неблагоприятных факторов среды.
Цель исследования
Установление образование долгоживущих радикалов белков, образующихся в сыворотке крови при воздействии лазерного излучения и тепла. Изучение их возможной сигнально-регуляторной роли в активизации защитных систем организма.
Материалы и методы исследования
В качестве белков сыворотки крови млекопитающих были исследованы бычий сывороточный альбумин (БСА, «Sigma», США) и бычий гамма-глобулин («Serva», ФРГ).
Определение перекиси водорода проводилось с помощью усиленной хемилюминесценции в системе люминол-парайодфенол-пероксидаза с регистрацией величины хемилюминесценции жидкостным сцинтилляционным счетчиком для измерения бета-излучения в режиме счета одиночных фотонов [5].
Для определения гидроксильных радикалов был использован селективный высокочувствительный зонд кумарин-3-карбоновая кислота, продукт реакции которой с ОН-радикалами, 7-гидроксикумарин-3-карбоновая кислота, обладает интенсивной флуоресценцией [4].
Для обнаружения и исследования ДЖРБ нами был использован метод измерения хемилюминесценции белковых растворов, индуцированной теплом (45°С), лазерным излучением (гелий-неоновое излучение, 632.8 нм, 5 мВт) и рентгеновским излучением (рентгеновская терапевтическая установка РУТ-15, 15 мA, 200 кВ, МосРентген, Россия, мощность дозы 1 Гр/мин, фокусное расстояние 0.375 м) с помощью высокочувствительного хемилюминометра Биотокс-7АМ (АНО Инженерный центр экология, Россия).
Результаты исследования и их обсуждение
АФК в организме возникают как при нормальном клеточном метаболизме, так и при воздействии разных физико-химических факторов. При достижении АФК уровня, превышающего возможности их нейтрализации антиоксидантной системой клетки, они вызывают окислительный стресс и оказывают повреждающее действие на биологические молекулы. Значительная часть повреждений в клетке, индуцированных ионизирующей радиацией, образуются за счет короткоживущих АФК, обусловленных радиолизом воды. После воды, содержание которой в клетках составляет около 75%, основной мишенью воздействия АФК являются белки [3, 8]. Содержание белкового компонента в клетках - около 15% их массы (примерно 70% сухого веса клетки) - наибольшее среди остальных клеточных компонентов. Кроме того, белки содержат целый ряд легко окисляемых групп.
При воздействии высоких доз ионизирующего излучения в присутствии кислорода АФК, образующиеся в результате радиолиза воды, продуцируют долгоживущие радикалы белков (ДЖРБ) [8].
Установлено, что ДЖРБ являются источником вторичных свободных радикалов, вызывающих дальнейшее окисление белков и других биомолекул, включая ДНК [5, 6]. При высоких дозах облучения они могут длительное время продуцировать генерацию АФК и оказывать генотоксическое действие на ДНК [3]. Длительная генерация АФК под действием ДЖРБ может быть причиной возникновения продолжительного окислительного стресса после прекращения воздействия ионизирующей радиации. Нейтрализация АФК, продуцируемых ДЖРБ, введением в организм некоторых природных антиоксидантов способна прерывать окислительный стресс, обусловленный этим фактором [3].
Так как тепловое воздействие, как и ионизирующее излучение [4], вызывает продукцию АФК, в данной работе впервые исследовано образование ДЖРБ белками сыворотки крови - альбумином и гамма-глобулином быка - при умеренной гипертермии и показаны существование ДЖРБ и генерация ими АФК.
Зависимость интенсивности хемилюминесценции от концентрации БСА и ГГ имела двухфазную колоколообразную форму. При ~15 мкМ БСА и ~3 мкМ ГГ хемилюминесценция растворов достигала максимальных значений. Эти концентрации белков использовали для определения времени их полужизни по уменьшению величины хемилюминесценции после теплового воздействия. Учитывая молекулярные массы БСА и ГГ (67 кДа и 150 кДа соответственно; соотношение 1 : 2.24) и значения концентраций этих белков, соответствующие максимальным величинам хемилюминесценции (0.44 г/л для БСА и 1 г/л для ГГ; соотношение 1 : 2.27), было определено, что максимальное количество люминесцирующих продуктов, образующихся в результате теплового воздействия, в среднем приблизительно одинаково, в расчете на единицу массы этих белков.
Была получена зависимость интенсивности хемилюминесценции белков после воздействия нагревания при 45°С от времени. Время полужизни радикалов БСА и ГГ составляло около 4 ч при воздействии тепла в диапазоне 35-50°C.
При этом вклад в хемилюминесценцию белка отдельных аминокислот может различаться [1].
Продукция Н2О2 после 2 ч прогрева при 45°C от концентрации белков имела двухфазную зависимость. В случае ГГ наблюдается двухфазная зависимость образования Н2О2 после теплового воздействия с четко выраженным максимумом при 1-2 мкМ белка. Для БСА двухфазная зависимость более полога с наибольшим значением при 10 мкМ белка. В обоих случаях через 1 ч после прогрева концентрация Н2О2 составляла около 40 нМ. Концентрации ГГ - 2 мкМ и БСА - 10 мкМ, которые давали максимальный эффект, были использованы в дальнейшем для измерения содержания Н2О2 в течение 6 ч после теплового воздействия. В контрольном растворе без белка концентрация Н2О2 составляла около 4-5 нМ и уменьшалась к 6 ч до 1 нМ. В растворе БСА наблюдалось плавное увеличение концентрации Н2О2 в течение 4 ч, а затем быстрое ее уменьшение к 6 ч. В случае ГГ происходил рост ее концентрации до 1 ч с последующим уменьшением к 6 ч. Можно полагать, что в течение времени полужизни ДЖРБ, которое составляет около 4 ч, происходит интенсивная генерация Н2О2, приводящая к росту ее концентрации для БСА в течение 4 ч и 1 ч в случае ГГ с последующим распадом.
Максимальная продукция Н2О2 после 15 мин воздействия гелий-неонового лазерного излучения для БСА и ГГ составила 7 и 2 мкМ соответственно.
В растворах БСА и ГГ после 2 ч нагревания при 45°C содержание 7-ОН-кумарин-3-карбоновой кислоты составляло 8±1 нМ для БСА и 15±2 нМ для ГГ (М±m, n=3).
Ранее было установлено, что длительное облучение иммуноглобулинов низкоинтенсивным ближним ультрафиолетовым излучением при 312 нм приводило к генерации Н2О2 из растворенного кислорода воздуха путем перевода его в синглетное состояние [10]. При этом продукция Н2О2 происходила преимущественно для ГГ и существенно превышала ее образование для альбуминов и других белков при сопоставлении их эквимолярных концентраций. В нашем исследовании при тепловой активации белков такой выраженной способности ГГ генерировать Н2О2 по сравнению с БСА не наблюдается. Возможно, вывод [10] о специфичности молекул ГГ в этом процессе является некорректным в результате сравнения эквимолярных концентраций таких сильно различающихся по массе белков, как БСА и гамма-глобулин. В работе [7] показано, что активация белков при УФ-облучении, сопровождающаяся образованием синглетного кислорода с последующей продукцией Н2О2, происходит в результате возбуждения ароматических аминокислот. При этом специфичности в отношении ГГ, по сравнению с БСА, не наблюдается.
Заключение
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что белки сыворотки крови - альбумины и глобулины - способны образовывать ДЖРБ при воздействии лазерного излучения и тепла. Они могут являться компонентами системы антиоксидантной защиты, приводящей к инактивации синглетного кислорода, образующегося при воздействии УФ-излучения [10], видимого света и тепла [2]. Кроме того, ДЖРБ могут играть сигнально-регуляторную роль в процессах, связанных с образованием Н2О2 [8,9]. Однако необходимо учитывать, что образование АФК под воздействием тепла свыше возможностей их инактивации системами антиоксидантной защиты может приводить к тем же последствиям, что и действие ионизирующей радиации.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, гранты 13-04-00730-а и 12-04-31324-мол_а
Рецензенты:
Брусков В.И., д.х.н., профессор, заведующий лабораторией изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.
Гудков С.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории изотопных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук, г. Пущино.