Введение
Патогенез многих заболеваний в настоящее время претерпевает дополнительную расшифровку в связи с появлением новых научных данных о ряде молекулярных событий в иммунной системе человека. Одним из основных свойств иммунной системы является способность к обнаружению и распознаванию чужеродных веществ и развитию ответных реакций, направленных на выведение или связывание этих веществ.
При оценке состояния системы иммунитета в клинических и научных исследованиях несколько десятилетий изучались показатели адаптивного иммунитета. Адаптивный (лимфоцитарный) иммунитет является мощной защитой, обеспечивающей целенаправленный антигенспецифический иммунный ответ с формированием иммунологической памяти. Разработаны системные подходы к оценке показателей иммунитета, предложены многочисленные схемы иммунокоррекции при различных заболеваниях.
В настоящее время стало понятным, что адаптивный иммунный ответ является лишь эффекторным звеном врожденной иммунной системы. Система врожденного иммунитета, являясь филогенетически более древней линией защиты организма от патогенов, инициирует воспаление и фагоцитоз и обеспечивает быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще отсутствуют. В отличие от адаптивного иммунитета, функционирование которого обеспечивают Т- и В-лимфоциты, механизмы врожденной защиты не имеют какой-либо дифференцированной системы клеток, а представляют собой разнообразные рецепторы, молекулы и их комплексы, которые присутствуют на разных клетках и имеют одинаковое предназначение [9]. Задачей врожденных механизмов защиты является распознавание одинаковых структур, присутствующих у различных патогенов, подобные структуры называют патогенассоциированные молекулярные образы (pathogen-accociated molecular patterns-PAMPs), а рецепторы, распознающие данные «образы», называют патогенраспознающие (pathogen recognition receptops-PRRs) [9, 10]. Миграция клеток к очагу повреждения контролируется распознаванием PAMP сосудистым эндотелием. В целом распознавание PAMP эндотелиальными, эпителиальными, гемопоэтическими клетками с помощью специфических рецепторов является интегральным для врожденного противоинфекционного иммунитета. Наиболее изученными PAMPs являются липополисахариды бактериальной стенки, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, липотейхоевые кислоты, маннаны, зимозан грибов, ДНК и РНК бактерий и вирусов. Результаты научных исследований последних лет подтверждают, что в качестве PAMPs могут участвовать не только молекулярные структуры микроорганизмов, но и вещества немикробного происхождения. Было доказано, что к PAMPs относятся и различные эндогенные соединения макроорганизма, высвобождающиеся при массивном повреждении клеток, такие молекулы получили название «сигналы опасности» (damage associated molecular patterns-DAMPs). К DAMPs относят фибронектин, фибриноген, белки теплового шока Hsp70 и Hsp 60, которые вызывают выработку провоспалительных цитокинов при действии на TLR4 и TLR2 [6].
В зависимости от предназначения и функций патогенраспознающие рецепторы разделяют на три группы: секретируемые, эндоцитозные и сигнальные. Секретируемые PRRs выполняют функцию опсонинов, «помечая» микробные клетки и облегчая фагоцитоз. Эндоцитозные PRRs опосредуют разрушение патогена в лизосомах клеток макроорганизма и презентируют пептидные фрагменты макрофагам, сигнальные PRRs активизируют передачу сигнала в ядро клетки с целью экспрессии генов адаптивного (лимфоцитарного) иммунного ответа [9]. К настоящему времени известны несколько семейств сигнальных PRRs: Toll-подобные рецепторы (Toll-lice receptors-TLR), лектиновые рецепторы С-типа (C-tipe lectin receptors), рецепторы-мусорщики (scavenger receptors), NOD-подобные и RIG-подобные рецепторы [4].
Важность участия Toll-подобных рецепторов в деятельности иммунной системы было доказано в экспериментах на мышах с мутациями генов различных TLRs, где прослежена взаимосвязь с приобретенным иммунитетом через антигенпрезентирующие клетки [8]. Эти исследования послужили основой комплексного анализа системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека. В настоящее время роль рецепторов врожденного иммунитета широко обсуждается при изучении патологии новорожденных детей, в исследованиях патогенеза различных дерматозов, колонизационной резистентности урогенитального тракта, регуляции противоопухолевого иммунитета, развития острого инфаркта миокарда и других заболеваниях [1,2,3,5,7,11].
Цель исследования
Изучение экспрессии и функциональной активности TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови у пациентов с тяжелой термической травмой в острый период ожоговой болезни.
Материал и методы исследования
Группу здоровых доноров периферической крови составили 12 человек в возрасте от 20 до 45 лет. Группу обследованных пациентов составили 23 человека с тяжелой термической травмой на площади от 32 % до 60 % поверхности тела. Больные находились на стационарном лечении в ожоговом центре Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии, исследования проводились в острый период ожоговой болезни.
Выделение мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной крови (25 ЕД на 1 мл) с помощью градиентного центрифугирования при 1500 об/мин (градиент фиколл-урографин (ρ=1,077 г/см3) 40 минут и дважды отмывали средой RPMI 1640 при 1500 об/мин в течение 10 минут. После чего культивировали МНК в полной ростовой среде RPMI 1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (ООО «ПанЭко»), 2 % Мм глутамина и антибиотики (пенициллин 100 EД/мл и стрептомицин 50 мг/мл, ООО «ПанЭко»). Исходная концентрация МНК составляла 1×106 клеток/мл.
Стимуляция клеток. В качестве лигандов TLR использовали стимуляторы ЛПС (E.coli O127: B8; Sigma) в дозе 0,1 мкг/мл и пептидогликан (Staphylococcus aureus; «Sigma») в дозе 5 мкг/мл. Оптимальные дозы были выбраны на основании методических рекомендаций фирм производителей используемых лигандов и литературных данных. Клетки инкубировали в СО2 инкубаторе фирмы Sanyo (Япония) при 5 % СО2, 37 ⁰С и абсолютной влажности. Спонтанную выработку фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) определяли, культивируя МНК в полной ростовой среде без стимуляторов. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут. Отбирали супернатанты и хранили их в течение 1-2 месяцев при 80 ºС. Рассчитывали индекс стимуляции как отношение количества ФНО-α при использовании соответствующего лиганда к спонтанной выработке цитокина клетками.
Определение цитокинов. Продукцию ФНО-α определяли в супернатантах культур методом ИФА с помощью тест-систем фирмы Bioscience (США) на анализаторе Sunrise Tecan (Австрия), оснащенном системой Magellan, позволяющей в автоматическом режиме производить подсчет оптической плотности.
Определение экспрессии TLR. Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови МНК инкубировали с Fitc-меченными антителами к CD14 (Beckмan Coulter, США), PE-меченными антителами к TLR2 и APC-меченными антителами к TLR4 (Bioscience) с соответствующими изотипическими контролями (Beckмan Coulter) в течение 30 минут при 4 ºС. Анализ экспрессии СD14, TLR2 и TLR4 проводили на проточном цитофлюориметре (Beckмan Coulter). Оценивали процент моноцитов, несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4 и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флюоресценции.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica.
Результаты исследования и их обсуждение
Изучение экспрессии TLR и их функциональной активности у тяжелообожженных больных является в определенной степени предварительным. Как показали результаты работы, экспрессия TLR2 на моноцитах периферической крови пациентов в первые пять суток после ожога достоверно выше, чем в группе доноров (p<0,05). Экспрессия TLR4 рецепторов, напротив, в острый период после травмы снижена (p<0,05, табл.1). Средняя интенсивность флюоресценции для TLR2 и TLR4 у тяжелообожженных больных значительно ниже, чем у здоровых доноров.
Таблица 1. Экспрессия TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови пациентов с тяжелой термической травмой и здоровых доноров
Группа обследованных |
TLR2 |
СИФ |
TLR4 |
СИФ |
Доноры |
55,6± 11% |
100,0± 9,0 |
42± 4,6% |
97,8± 12,4 |
Пациенты |
97,3± 8,9% |
13,4±5,1 |
27,04± 6,2% |
3,08±0,9 |
Параллельно с изучением экспрессии Toll-подобных рецепторов анализировали выработку ФНО-α CD14+ клетками. Спонтанная выработка ФНО-α МНК периферической крови пациентов с тяжелой термической травмой была многократно выше, чем в группе доноров (табл. 2).
Таблица 2. Выработка ФНО-α МНК периферической крови здоровых доноров и пациентов с тяжелой термической травмой (пкг/мл)
Группа обследованных |
Спонтанная выработка |
Стимулированная ПГ |
Стимулированная ЛПС |
Доноры |
25,4±6,8 |
59,7±3,2 |
687±18,8 |
Пациенты |
1369±820 |
2152±976 |
3284±1080 |
Стимуляция МНК лигандами TLR приводила к увеличению продукции ФНО-α, однако в группе доноров индекс стимуляции составил 2,3 при использовании пептидогликана и 27,0 при использовании липополисахарида, а в группе пациентов - лишь 1,7 и 2,4 соответственно. Таким образом, острый период ожоговой болезни после тяжелой термической травмы характеризуется изменением экспрессии Толл-подобных рецепторов на мононуклеарных клетках периферической крови и усилением их функциональной активности, однако общий потенциал TLR2 и TLR4 у пациентов относительно показателей у доноров достоверно снижается. Низкий прирост уровня ФНО-α в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 может служить причиной ослабления защитных функций у тяжелообожженных при развитии ожоговой инфекции. Зависимости экспрессии TLR2 и TLR4 от этиологии раневой ожоговой инфекции в период наблюдений не было выявлено, направленность изменений сохранялась как у пациентов с грамотрицательной, так и у пациентов с грамположительной инфекцией. Динамический анализ изученных показателей в процессе лечения ожоговой болезни показал достаточную разнонаправленность как экспрессии Толл-подобных рецепторов, так и выработки ФНО-α МНК, вместе с тем наблюдалась прямая зависимость течения болезни и выраженности изученных показателей. У двух пациентов с летальным исходом болезни регистрировали резкое снижение функциональной активности TLR в отношении и спонтанной продукции ФНО-α, и стимулированной лигандами TLR практически до нуля, при этом экспрессия рецепторов соответствовала таковой у выживших пациентов.
Выводы
Таким образом, анализ выработки цитокинов стимулированными лигандами TLR мононуклеарных клеток периферической крови и определение поверхностной экспрессии CD14+ Толл-подобных рецепторов дают важную информацию при оценке функционального состояния врожденного иммунитета и должны рассматриваться в качестве маркеров течения ожоговой болезни. Лекарственные воздействия через Толл-подобные рецепторы, по всей вероятности, могут дать возможность управления выраженностью системной воспалительной реакции в разные периоды ожоговой болезни.
Рецензенты:
Никифоров В.А., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией микробиологии ФБУН ННИИЭМ им. Академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, г. Нижний Новгород.
Заславская М.И., д.б.н., профессор кафедры микробиологии и иммунологии, ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России, г. Нижний Новгород.