Scientific journal

Modern problems of science and education

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Введение

Несмотря на то что методика культивирования и индукции эмбриогенеза в микроспорах рапса достаточно рутинна, существуют две проблемы, которые ограничивают более широкое её использование, а именно: 1) высокая зависимость процесса эмбриогенеза от генотипа растения; 2) вторичный и часто аномальный эмбриогенез [1; 3; 7].

Недавно на Brassica napus cv. Topaz было показано, что при определенных условиях (при правильном подборе параметров температурного шока) через 8-9 дней культивирования происходит разрыв стенки микроспоры и образуется нитевидная структура, состоящая из отдельных рядов клеток (суспензорподобная структура) [6]. В последующие дни происходит продольное деление верхней периферической клетки и формируется эмбрионоподобная структура. Эмбрионы, развившиеся подобным образом, абсолютно идентичны с зиготическими зародышами и способны развиться в нормальные растения, а их развитие происходит гораздо быстрее, чем обычно. Данная технология была использована на сорте Topaz и описана в деталях исследователями из Нидерландов [6] как удобная модель для изучения механизма эмбриогенеза. Недавно эта методика показала свою эффективность на сортах рапса иностранной селекции (Resch и Touraev, неопубликованные результаты).

Целью настоящего исследования было сравнение и оценка протоколов получения удвоенных гаплоидов рапса, через классический эмбриоидогенез и через образование суспензорподобных структур, на различных сортах отечественной селекции.

Материалы и методы исследования

Растительный материал. В эксперименте использовались отечественные сорта рапса (Brassica napus cv) ярового: Ратник, Викинг, Таврион, и озимого: Оникс, Метеор, Дракон. Сорт рапса Топаз был использован в качестве положительного контроля, так как для него уже существует эффективный протокол получения удвоенных гаплоидов.

Среды для культивирования. Для выделения микроспор была использована жидкая среда B-5 [2], содержащая макро- и микросоли, Fe-EDTA, 100 мг/л миоинозитола и 10% сахарозы. Для культивирования микроспор и индукции эмбриогенеза была использована жидкая среда NLN-13 [4] с содержанием сахарозы 13%.

Выделение микроспор. Цветочные бутоны Brassica napus cv. (длиной 3,2-3,5 мм), содержащие микроспоры на поздней одноядерной или на ранней двуядерной стадии развития пыльцы, были поверхностно простерилизованы 70%-ным этанолом в течение 30 секунд и затем трижды промыты холодной (4 °С) стерильной водой. Бутоны были осторожно мацерированы с помощью шпателя в 1,5 мл жидкой холодной (4 °С) среды B-5 для высвобождения микроспор из пыльников и после этого ресуспендированы в 10 мл среды B-5 (4 °С). Суспензия была отфильтрована через 40-μм нейлоновый фильтр в стерильную центрифужную пробирку для удаления тканей пыльника. Затем суспензию центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут для очистки микроспор от мелких частей пыльника. Супернатант удаляли, а осажденные микроспоры промывали путем двукратного центрифугирования в холодной среде B-5 по 3 мин при 1000 об/мин. Осажденные микроспоры ресуспендировали в среде NLN-13 до плотности 4x10⁴ на 1 мл среды и культивировали в плашках (6 лунок, NUNC, Denmark) в темноте при температуре:

1) 30 °C в течение 3 дней (температурный шок) для индукции классического эмбриоидогенеза;

2) при температуре 33 °C в течение 18 часов для индукции образования суспензорподобных структур.

Эмбриогенез и регенерация растений. После периода воздействия высокими температурами микроспоры переносили на медленно вращающийся шейкер (50 rpm) в темноту на 25 °C и культивировали до тех пор, пока эмбрионы не были видны невооруженным глазом (10-14 дней). После этого хорошо развитые эмбрионы переносили на твердую среду, содержащую соли и витамины Мурасиге-Скуга [5], 10% сахарозу, 10% глюкозу, 0.5% активированный уголь и 0.7% растительный агар.

Обработка колхицином и культивирование растений. Обработка колхицином проводилась на уровне проростков, содержащих 2-3 листа в стерильных контейнерах с вермикулитом, смоченным жидкой ½ B5 средой, содержащей раствор колхицина (0.5% колхицин + 0.1% DMSO). Культивирование осуществляли при температуре 20-23 °C с 16-часовым фотопериодом в течение 2 суток. После обработки колхицином растения переносили в стерильные контейнеры со ½ B5 средой без колхицина и культивировали при тех же условиях в течение 2 недель. Затем растения переносили в почву и доращивали до стадии 4 листьев, после чего проводили яровизацию растений при 6 °C, 16-часовом фотопериоде и интенсивности освещения 5 тыс. люкс в течение 6 недель.

Анализ плоидности. Для анализа плоидности использовали листья растений, сформированные после обработки колхицином. Плоидность определяли с использованием проточного цитометра фирмы Partec по стандартному протоколу фирмы-производителя (N05-5003 CyStain UV Precise T).

Результаты исследования и их обсуждение

Нами было проведено сравнение двух методик получения гаплоидных и дигаплоидных растений рапса (классический эмбриоидогенез в культуре микроспор и эмбриоидогенез микроспор через формирование суспензорподобных структур) на сортах отечественной селекции. Сорт Топаз (Topaz) был использован в качестве положительного контроля.

Эмбриогенез микроспор рапса в культуре in vitro является результатом переключения развития микроспоры с гаметофитного на спорофитный путь после теплового стресса. Подобное воздействие первоначально вызывает формирование тотипотентной эмбриогенной микроспоры с характерными цитологическими особенностями (ядро в центре вакуолизированной клетки), которая при переносе на богатую среду и нормальную температуру начинает делиться симметрично и формирует многоклеточную структуру, покрытую наружной оболочкой микроспоры (экзины) [6; 8; 10]. После выхода из экзины эти клеточные структуры развиваются последовательно в глобулярные, сердцевидные, торпедообразные и зрелые зародыши, способные к регенерации в целое растение после переноса в соответствующие условия [6; 9]. Этот путь обычно наблюдается у большинства растений, для которых разработана данная методика (табак, пшеница, ячмень, рапс и др.), и считается классическим эмбриоидогенезом.

Классический эмбриоидогенез в культуре микроспор отечественных сортов рапса. Через два дня после температурного шока 15-25% изолированных микроспор делились симметрично и от 2 до 5% популяции клеток через 10 дней развивались в глобулярно-сердцевидную стадию. Через две недели можно было наблюдать хорошо развитые зародыши, которые переносили на среду для регенерации гаплоидных проростков. На стадии 3-4 листьев проростки обрабатывают колхицином для получения удвоенных гаплоидов.

Эмбриоидогенез через образование суспензорподобных структур. На предварительных этапах исследования А.Тураевым было обнаружено, что уменьшение периода теплового стресса и увеличение температуры до 33 °C приводило к значительному увеличению частоты формирования суспензорподобных структур из микроспор, что полностью согласуется с оригинальными работами Supena и коллег [6]. При культивировании в течение 18 часов с использованием указанной температуры почти 50% микроспор образовывали суспензорподобные структуры, тогда как увеличение длительности теплового стресса приводило к уменьшению доли таких структур. Чувствительность к температурному стрессу варьировалась в зависимости от стадии развития культивируемых микроспор рапса. Было установлено, что оптимальная популяция микроспор должна состоять из 60% поздних одноклеточных микроспор.

Сравнение двух методов. Нами было установлено, что эмбрионы с суспензором развиваются медленнее. Так, микроспоры при классическом пути эмбриоидогенеза начинали деление уже на первый-второй день культивирования, через четыре дня они формировали проэмбрио, а на 8-й развивались до глобулярной и ранней сердцевидной стадии. Напротив, микроспоры, из которых развивались суспензорподобные структуры, начинали делиться только к 6-му дню, а на 8-й день состояли из 2-8 клеток. Через две недели культивирования зародыши без суспензора достигали стадии «торпеды» и составляли в длину 1-3 мм, тогда как зародыши с суспензором в это же время были в глобулярной или же в сердцевидной стадии.

Данные по эффективности методик на отечественных сортах рапса и в контроле приведены в таблицах 1-3. Эффективность формирования эмбриоидов через классический эмбриоидогенез у отечественных сортов составила от 1,9 до 15,5 эмбриоида на используемый бутон. При этом эмбриоидогенез среди яровых сортов был выше, чем среди озимых. Эффективность в контроле (Топаз) составила 21,4 эмбриоида/бутон. Нами наблюдались аномалии в развитии зародышей, проявляющиеся в формировании вторичных эмбриоидов и каллусных структур.

Формирование эмбриоидов через образование суспензорподобных структур у отечественных сортов происходило с эффективностью 2,2-14,4 эмбриоида/бутон. При этом, так же как и в случае классического метода, эмбриоидогенез среди яровых сортов был выше, чем среди озимых. Эффективность в контроле (Топаз) составила 22,2 эмбриоида на почку.

Достоверных отличий в эффективности формирования эмбриоидов между двумя методиками отмечено не было, однако в случае, когда зародыши формировались через суспензорподобные структуры, они имели более классическое (зиготическое) строение и развивались без образования вторичных эмбриоидов и каллусных структур.

Таблица 1. Эффективность эмбриогенеза микроспор у различных генотипов рапса

Через 2 недели после переноса эмбриоидов на твердую среду Мурасиге-Скуга проводили оценку эффективности регенерации. Эффективность оценивали по количеству нормальных зеленых растений-регенерантов.

Эффективность регенерации растений из эмбриоидов, полученных через классический эмбриоидогенез у отечественных сортов, составила от 10 до 58%. Эффективность в контроле (Топаз) составила 61%.

Регенерация растений из эмбриоидов, полученных через образование суспензорподобных структур, у отечественных сортов происходило с эффективностью 18-69%. Регенерация среди яровых сортов была выше, чем среди озимых. Эффективность в контроле (Топаз) составила 76%.

Общая средняя эффективность регенерации растений при использовании метода суспензорподобных структур была на 10% выше, чем при классическом методе.

Таблица 2. Эффективность регенерации растений из эмбриоидов у различных генотипов рапса

Таким образом, можно сделать вывод о том, что оба метода подходят для использования на сортах рапса отечественной селекции. Уровень регенерации и выход удвоенных гаплоидов с использованием данных методов не намного ниже, чем у контрольного сорта Топаз, который считается лидером по эффективности получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор.

Полученные растения-регенеранты обрабатывали 0.5%-ным колхицином, и после образования новых листьев проводили анализ плоидности.

Эффективность получения удвоенных гаплоидов рапса среди отечественных сортов в среднем составила около 32%. У контрольного сорта Топаз эта величина составила 34%.

Таблица 3. Эффективность формирования удвоенных гаплоидов рапса после обработки 0,5%-ным колхицином

Заключение

Таким образом, можно сделать вывод о том, что оба метода могут быть с успехом использованы для получения гомозиготных двойных гаплоидов на сортах рапса отечественной селекции, исследованных в данной работе. Следует отметить, что в методике с использованием суспензорподобных структур эмбрионы выглядели и развивались без аномалий (формирование вторичных эмбриоидов и каллусных структур). Абсолютный выход растений был достаточным в обоих методах, чтобы использовать их для получения удвоенных гаплоидов большинства отечественных сортов. Уровень регенерации и выход удвоенных гаплоидов с использованием данных методов был не намного ниже, чем у контрольного сорта Топаз, который считается лидером по эффективности получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, соглашение № 8483.

Рецензенты:

Равин Н.В., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории систем молекулярного клонирования, заместитель директора Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва.

Коротков Е.В., д.б.н., руководитель группы компьютерного анализа последовательностей ДНК и белков Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва.