Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

APPLICATION OF BARLEY DOUBLED HAPLOIDS IN GENETICS AND BREEDING

Mishutkina Ya.V. 1 Neskorodov Ya.B. 1 Novokreschenova M.G. 2 Malakho S.G. 2 Turaev A.M. 2
1 Centre “Bioengineering” RAS
2 Lomonosov Moscow State University
Удвоенные гаплоиды ячменя широко используются на протяжении последних 30 лет, в селекционных программах и для изучения ряда научно-практических проблем. Изначально для получения гаплоидных растений был использован метод элиминирование хромосом при удаленной гибридизации (Bulbosum-метод), который и сейчас активно пользуется в селекционных программах ряда компаний. Позднее были разработаны эффективные способы получения удвоенных гаплоидов из культивируемых in vitro пыльников и микроспор. На сегодняшний день ячмень можно считать модельным представителем злаковых культур по производству и исследованию гаплоидов. Удвоенные гаплоиды ячменя были использованы для разработки молекулярных маркеров и при составлении хромосомных карт. Методы культивирования пыльников и микроспор совмещенные с современными молекулярно-диагностическими методами значительно продвинули исследования в области изучения андрогенеза и эмбриогенеза у однодольных. Использование гаплоидов ячменя для генетичеcкой трансформации позволило получать гомозиготные по трансгену растений уже в первом поколении.
Doubled haploid barley is widely used during last 30 years in barely breeding programmes and in fundamental-applied research. First haploid barley plants were obtained using chromosome elimination during distance hybridization with Hordeum bulbosum (Bulbosum method). This technology is still in use in breeding programs of several companies. Later the method of isolating and culturing in vitro anthers and microspores were established as an efficient technology of doubled haploid production in barley. Nowadays barley can be evaluated as a model cereal for haploid and doubled haploid studies. Doubled haploids were used for creating molecular markers and chromosome mapping. Isolated barley microspore cultures in combination with molecular biology and genomics methods led to studies of the mechanism of microspore embryogenesis and doubled haploid formation. Application of haploid microspores as target for genetic transformation led to the generation of homozygous transgenics already in the first generation.
in vitro.
embryogenesis
androgenesis
double haploids
barley

Ячмень - чрезвычайно важная сельскохозяйственная культура для России. Зерно ячменя широко используется для продовольственных, технических и кормовых целей. Большая вовлечённость этой культуры в производственный процесс формирует основные задачи её селекции, которыми являются создание высокопродуктивных и устойчивых к неблагоприятным факторам среды озимых и яровых сортов для различных почвенно-климатических зон. Генетическая однородность также является необходимым требованием для регистрации новых сортов во многих странах мира. Подобная однородность обычно достигается путем инбридинга и отбора гомозиготных линий в течение нескольких поколений. Для закрепления в популяции любого хозяйственно-ценного признака необходимо более восьми направленных скрещиваний, что, при условии проведения работы на однолетних растениях, занимает не менее восьми лет. Использование методов получения удвоенных гаплоидов позволяет достичь гомозиготности в одном поколении и, следовательно, сэкономить несколько поколений времени в селекции новых сортов [24, 40].

Удвоенные гаплоиды представляют собой гомозиготные организмы, имеющие двойной набор одинаковых хромосом. Подобная генетическая организация позволяет точно локализовать на хромосоме и описать широкий спектр не только доминантных признаков, но и рецессивных, которые обычно скрыты у гетерозиготных растений (например, очень важными для селекции ячменя являются гены мужской стерильности, которые рецессивны и могут быть выявлены только у гомозиготных растений) [5]. Генетическое расщепление при использовании дигаплоидов менее сложно, что позволяет использовать для выделения определённой комбинации генов сравнительно малочисленные популяции [36, 37, 40].

Из-за своей генетической однородности удвоенные гаплоиды широко используются при поиске молекулярных маркеров. Например, у ячменя большинство генетических карт было построено с использованием именно этой технологии [3, 5]. Гаплоидные и удвоенные гаплоидные линии ячменя (и других культур) и методики их получения также широко используются для генетических исследований, индуцированного мутагенеза, клеточной селекции, генетической трансформации и изучения андро- и эмбриогенеза. [6, 7, 27].

Первые гаплоидные растения ячменя были получены в 1970 году с использованием метода межвидовой гибридизации ячменя обыкновенного (H. vulgare) с ячменём луковичным (H. bulbosum) [20]. В культуре in vitro первые гаплоидные растения были получены из пыльников в 1973 году [4], затем в 1976 году из семяпочки [30] и в 1991 году из изолированных микроспор [17].

На сегодняшний день в мире зарегистрированы сотни, если не тысячи, разновидностей удвоенных гаплоидов ячменя. К сожалению, до сих пор не существует их полного перечня. Однако, на сайте COST 851 [35] приведен список некоторых яровых и озимых разновидностей ячменя. Каждый год по всему миру регистрируются новые удвоенные гаплоиды (большей частью в Европе, Канаде, США, Австралии). Традиционные возражения против получения удвоенных гаплоидов in vitro, связанные с возникновением сомаклональной изменчивости, потерей генетического разнообразия и меньшей стабильностью признаков все еще широко обсуждаются [40]. Тем не менее, появляется все больше селекционных программ, полностью основанных на использовании гаплоидии [8].

Следует учитывать, что использование гаплоидов - это только небольшая техническая ступень в общей программе селекции. Успешность использования удвоенных гаплоидов в создании новых сортов - результат объединения биотехнологической работы в лаборатории и полевых селекционных методов. Интеллектуальные затраты при планировании скрещивания и всей программы в целом, знания в области маркетинга и удача в полевых экспериментах являются в равной степени необходимыми составляющими успешности проектов по созданию новых урожайных и устойчивых к вредителям сортов как ячменя, так и других хозяйственно ценных культур [10].

Метод получения гаплоидных растений ячменя через элиминирование хромосом

Данный метод основан на феномене элиминирования половины хромосом в клетках гибридного ячменя на ранних стадиях эмбриогенеза [13, 19]. Этот процесс можно наблюдать при межвидовом скрещивании ячменя (H. vulgare) с ячменём луковичным (H. bulbosum), при котором происходит элиминирование хромосом H. bulbosum. Данные метод совершенствовался на протяжении нескольких лет [26, 27, 32], что сделало его достаточно эффективным. К настоящему времени метод элиминирования хромосом позволил получить большое число гаплоидных и дигаплоидных линий и применяется в селекционных программах при работе с генотипами, которые демонстрируют устойчивость к другим техникам получения гаплоидных форм [24].

Метод получения гаплоидных растений ячменя в культуре пыльников

Методы культуры изолированной микроспоры и культуры пыльника - наиболее широко используемые в настоящее время системы для получения гаплоидов у растений [7, 36, 40]. Большое количество микроспор в пыльнике и пыльников в колосе позволяют получить большое число гаплоидов из одного колоса.

Впервые гаплоидные растения ячменя из культуры пыльников были получены в 1973 году [4]. Разработанные тогда протоколы продолжают совершенствоваться [2, 15, 16, 24, 28, 34], и сейчас суть метода заключается в следующем: из растений ячменя выращенных в контролируемых температурных и световых условиях, выделяют пыльники. Перевод микроспор (внутри пыльника) от гаметофитного к спорофитному пути развития осуществляется стрессовым воздействием либо на пыльники in vitro, либо на растения до выделения пыльников [24, 36]. В качестве стрессового воздействия обычно применяется низкотемпературный шок и углеводное голодание [14, 28, 31]. После стрессовой обработки пыльники переносят на искусственные жидкие питательные среды и культивируют до формирования эмбриоидов, которые, в свою очередь, переносят на твердые среды для регенерации, состав которых различается в зависимости от генотипов или целей эксперимента [7, 24].

Развитие растений в культуре изолированных пыльников in vitro может проходить двумя путями: прямая регенерация зародышей (эмбриоидогенез) и через каллусогенез [11, 24, 36]. В первом случае внутри пыльников из микроспор формируются проэмбриональные структуры, которые при определенных условиях культивирования развиваются в эмбриоиды (зародышеподобные структуры), дающие начало гаплоидным растениям [4, 24]. Эффективность формирования эмбриоидов является генотипзависимым процессом и может существенно различаться (от 0 до 95 %) [11, 24]. Во втором - микроспора делится, но клетки, возникшие в результате делений, быстро увеличиваются в размерах и, разрывая оболочку пыльцевого зерна, образуют каллус. В результате дальнейшего морфогенеза из этих каллусных клеток регенерируют растения [34]. При этом растения могут иметь разную степень плоидности - ди-, поли-, анеуплоидные и гаплоидные. Последние часто стерильны, но после обработки растений колхицином происходит удвоение числа хромосом, в результате чего можно получить фертильные гомозиготы [7, 17, 19, 33].

Большим преимуществом данного метода является высокий процент формирования спонтанных дигаплоидов среди растений-регенерантов - 60-80 %, что позволяет не использовать химические препараты для удвоения хромосом, которые являются токсичными для растений и людей [24].

Данная технология получила широкое распространение и применение для различных целей, но, тем не менее, у неё есть существенный недостаток, который заключается в формировании большого процента альбиносов среди растений-регенерантов [7, 24, 34].

Метод получения гаплоидных растений в культуре изолированных микроспор

Культура микроспор in vitro представляет собой процесс культивирования в жидкой питательной среде генеративных клеток, освобожденных от соматических тканей пыльника. Данный метод технологически отличается от культуры пыльников [9].

Главным отличием культуры изолированных микроспор от культуры пыльников является этап выделения микроспор из пыльника. Микроспоры извлекаются из пыльников на поздней одноядерной (перед митотическим делением) или ранней двуядерной (сразу после деления) стадии развития. Основная схема эксперимента по выделению и культивированию микроспор следующая [2, 9, 16, 17, 21, 22]: Пыльники извлекаются из фрагментов колосьев, разбиваются блендером несколько секунд в растворе 0,3 М маннитола. Полученная пульпа фильтруется через 100µм фильтр и центрифугируется несколько минут (3-5 минут) при щадящих условиях (50-100 g). После окончания центрифугирования, осадок из микроспор размешивается в растворе 0,3 М маннитола. Затем цикл с центрифугированием повторяют несколько раз, что необходимо для эффективного отмывания клеток микроспор. Дальнейшее культивирование микроспор осуществляется в жидких питательных средах, состав которых различается в зависимости от генотипов или целей эксперимента и обычно содержит мальтозу (в качестве источника углевода) и, иногда, стимуляторы роста.

Проведённые исследования, направленные на анализ эффективности методики получения гаплоидных растений, через культуру пыльников и через культуру микроспор, показали, что культура микроспор эффективнее [2, 22]. В настоящее время метод культуры микроспор особенно широко используется в современных селекционных программах для озимого и в меньшей степени для ярового ячменя [7, 10, 24].

Культура микроспор также широко используется для прикладных исследований. Так в культуре микроспор ячменя было показано влияние стрессовых факторов (голод, холод) на перепрограммирование пути клеточного развития от гаметофитного к эмбриогенезу и изучено участие каспазы-3, ROS и NO в стресс-индуцированном апоптозе [29]. Использование микрочипов в культуре микроспор ячменя позволило исследовать экспрессионный профиль эмбриогенеза микроспор индуцированного стрессовой обработкой [36].

Совсем недавно было показано, что технологию удвоенных гаплоидов ячменя можно использовать для получения безмаркерных трансгенных растений [18] и для маркирования хозяйственно-ценных признаков [23].

Другие Методы Производства Гаплоидов Ячменя

Гаплоиды ячменя также были получены с помощью культуры семяпочки [30] и с помощью гена инициации гаплоидности (hap) [12]. Однако трудности, сопряженные с этими подходами, не позволили широко их использовать. Метод культуры семяпочки совершенствовался, но процент жизнеспособного потомства оказался низок (0.2-1.4 %), а сама процедура трудоемка, что не позволило найти ему широкое применение для прикладных целей [41]. Ген hap отвечает за блокирование оплодотворения яйцеклетки, однако полярное ядро оплодотворяется и эндосперм развивается нормально. Яйцеклетка же развивается в гаплоидный эмбрион [5]. Таким образом, гаплоидное и диплоидное семя не различаются внешне. Необходимы дальнейшие исследования системы гена hap, чтобы она могла конкурировать с методами культуры пыльников или изолированных микроспор [5].

Генетический контроль гаплоидизации

Идентификация генов, вовлеченных в фомирование гаплоидов, была целью исследователей со времени открытия гаплоидов, но только сейчас прогресс в молекулярных исследованиях сделал возможным идентифицировать сотни генов, отвечающих за индукцию гаплоидии [1, 5, 7, 42, 43]. Инициирующий гаплоидию ген hap ячменя - это аллель, который содержит доминантную мутацию, стимулирующую партеногенез. Доминантный характер этой мутации создает определенные проблемы селекционерам, так как аллель hap должен быть удален из семян, поступающих на рынок.

Метод элиминации хромосом основан на существовании определенного геномного баланса после отдаленной гибридизации H. vulgare с H. bulbosum. Ho и Kasha (1975) показали, что генетические факторы, контролирующие этот баланс локализованы на обоих плечах хромосомы 2 и коротком плече хромосомы 3 ячменя [13]. Pickering (1985) обнаружил ген, отвечающий за несовместимость между ячменем и H. bulbosum на хромосме 5 [25]. Явление элиминации хромосом также известно для пшеницы и овса при скрещивании с кукурузой и просом [39]. Генотипы используемых при скрещивании растений также влияют на эффективность элиминации [26, 32].

Скрещивание генотипов, различающихся по различным признакам, и создание молекулярных маркеров для картирования позволяет определить гены, ответственные за количественные признаки - QTL (Quantitative Trait Loci). Zivy (1992) и Devaux (1994) с соавторами идентифицировали четыре локуса, связанные с развитием эмбриона и регенерацией растения [6, 43]. Chen (2007) с соавторами также обнаружили 3 подобные локуса [3].

Для молекулярного картирования, маркер-опосредованной селекции и изучения генетического разнообразия используются различные типы маркеров: AFLP, RAPD, SSR, EST, SNP и др. Varshney с соавторами (2007) разработали хромосомные карты ячменя с 775 маркерами SSR со средним расстоянием между маркерами в 1.38 cM [38]. Для идентификации и выделения генов используются базы данных EST (expressed sequence tags). Подобная база для ячменя была разработана в 2005 году [37, 39]. С помощью таких библиотек стало возможным создавать микрочипы для скрининга транскриптома и, таким образом, прослеживать влияние различных условий на экспрессию генов в ходе эмбриогенеза [42].

Наряду с идентификации генов, вовлеченных в процесс андрогенеза, этот процесс изучается и с цитологической точки зрения. Диплоидизации клеточного ядра при переходе к эмбриогенезу посвящен ряд работ [14, 15].

Образование растений-альбиносов в ходе регенерации растений из культуры тканей является частой проблемой при эмбриогенезе, поэтому внимание исследователей привлекает ультраструктура хлоропластов культуры микроспор. Caredda с соавторами (2004) обнаружили, что пропластиды в линиях, образующих альбиносов, редко делятся и имеют малое число тилакоидов [1]. Основной причиной альбинизма они считают деградацию ДНК в пластидах в ходе индукции эмбриогенеза.

Заключение

Гаплоиды (дигаплоиды) ячменя - ценный материал для селекции и изучения ряда научно-практических проблем, в том числе - связанных с изучением комбинативной изменчивости и поиском подходов для ее эффективного использования и закрепления в гомозиготных линиях. Вначале при создании гаплоидов получили развитие методы элиминирования хромосом и культуры пыльников. Относительно недавно получил развитие и метод культуры изолированных микроспор. В настоящее время, ячмень считается одним из модельных культурных растений среди злаковых. С его помощью были изучены гены, контролирующие индукцию микроспорового эмбриогенеза и гены, вовлеченные в развитие эмбриона. Как диплоидное растение ячмень часто используется для биохимических и цитологических исследований андрогенеза. Дигаплоидные популяции также используются для картирования хромосом и создания молекулярных маркеров. С усовершенствованием молекулярных, биохимических и цитологических методов исследования сдвинулись в область секвенирования ДНК и анализа транскриптомов, позволяя выявить сотни генов, отвечающих за индукцию эмбриогенеза в микроспорах. Трансформация ячменя также развивается во многом благодаря использованию гаплоидных систем в связи с их доступностью и возможностью немедленного получения гомозиготных по трансгену растений. Главным прикладным направлением использования удвоенных гаплоидов ячменя является ускоренная селекция новых сортов и гибридов.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, ГК № 14.512.11.0063.

Рецензенты:

Равин Н. В., д.б.н., профессор, руководитель лаборатории систем молекулярного клонирования, заместитель директора Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва.

Игнатов А. Н., д.б.н., руководитель группы молекулярной фитопатологии Центра «Биоинженерия» РАН, г. Москва.