Введение
Вирусы гриппа А, обладающие высокой степенью изменчивости генома, являются этиологическими агентами опасных инфекционных заболеваний человека и животных, способных протекать в форме обширных эпизоотий, эпидемий и пандемий с высокой смертностью [9]. Преодолевая межвидовые барьеры, вирусы гриппа способны проникать в популяции новых потенциальных хозяев, адаптироваться и циркулировать среди них достаточно продолжительное время. Вероятность преодоления вирусом межвидового барьера и формирования нового пандемического варианта резко возрастает в период обширных эпизоотий. Внимание исследователей привлекает современная эпизоотия высокопатогенного вируса субтипа H5N1, которая началась ещё в 1997 г. в Юго-Восточной Азии. Распространение вируса H5N1 может иметь катастрофические последствия в случае появления у этого вируса пандемического потенциала, так как, во-первых, у человечества отсутствует коллективный иммунитет к вирусам гриппа с гемагглютинином Н5, а во-вторых, летальность заболевших в результате заражения этим вирусом достигает 60%.
Другой стороной этой проблемы является возникновение лекарственной устойчивости у штаммов вируса гриппа, что делает необходимым постоянное тестирование современных гриппозных штаммов на устойчивость к препаратам и требует проведения антивирусной терапии при помощи нескольких препаратов с различными механизмами противовирусного действия для исключения формирования лекарственно устойчивых штаммов вируса гриппа.
Поэтому вопрос о необходимости разработки и поиска новых антигриппозных препаратов представляется крайне важным и особо актуальным.
Препараты природного происхождения, по сравнению с синтетическими лекарственными средствами, обладают мягким терапевтическим действием и низкой токсичностью, вследствие чего могут применяться в течение длительного времени [1; 14; 18].
Полученные из базидиальных грибов разные классы биологически активных веществ способны ингибировать репродукцию вирусов в организме, что делает их перспективными объектами для разработки на их основе противовирусных препаратов. Активными в отношении вирусов оказались полисахариды, белки, водорастворимые лигниноподобные соединения, гликозиды, гликопротеины, изопреноиды и другие [10-13].
Капич А.Н. и др. [4] приводит данные о каротиноидах, которые были выделены из Laetiporus sulphureus, обладающих антиоксидантной, радиопротекторной и антивирусной активностью.
Показано подавление ВИЧ-1 экстрактом Trametes versicolor, содержащим гликопротеины [11]. Из мицелиальной культуры получен коммерческий препарат «Крестин», поддерживающий клетки-киллеры иммунной системы. Помимо иммуностимуляции, комплексы полисахаридов с белками проявляют непосредственную антивирусную активность, а именно: во-первых, ингибируют прикрепление белка gp120 ВИЧ-1 к поверхностному CD4-рецептору клетки, а во-вторых, подавляют обратную транскриптазную активность вируса [12].
Pirano F. [14] создал на основе водного экстракта гриба Rozites caperata препарат белковой природы, препятствующий процессу репликации вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, цитомегаловирусов, респираторного синциального вируса и вируса гриппа типа А.
Mothana R.A.A. et al. [13] установили, что основными антивирусными компонентами экстрактов Ganoderma pfeifferi в отношении вируса гриппа типа А и вируса простого герпеса 1 типа были тритерпеноиды: ганодермадиол, луцидодиол, апланоксиновая кислота G.
Вещества хиспидин и хисполон, имеющие изопреноидную природу и найденные в этанольном экстракте гриба Inonotus hispidus, проявляли активность в отношении вируса гриппа типов А и В [10]. Антивирусную активность проявляли как экстракты плодовых тел, так и мицелиальные экстракты. В России подобные исследования только начинаются. Установлено, что каротиноиды из гриба Laetiporus sulphureus обладают антиоксидантной, радиопротекторной и антигерпетической активностью [4]. Первые исследования, проведенные нами, показали перспективность поиска продуцентов антивирусных соединений среди базидиальных грибов [3].
В связи с этим целью данной работы является изучение противовирусной активности экстрактов, выделенных из базидиальных грибов, в отношении высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) на культуре клеток MDCK и лабораторных животных.
Материалы и методы
Экстракты базидиальных грибов. В работе использовали водные экстракты, полученные из плодовых тел базидиомицетов Ganoderma applanatum (09-11), Laetiporus sulphureus (09-12) и склероция Inonotus obliquus (09-20, 09-24 и 09-26), способы подготовки которых приведены в таблице 1.
Вирус гриппа (ВГ). Для оценки противовирусной активности водных экстрактов базидиальных грибов в культуре клеток MDCK и на лабораторных животных, использовали штамм вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», наработанный на 10-суточных куриных эмбрионах (КЭ). Концентрацию вируса в исследуемых образцах определяли путем титрования в клетках MDCK [5], рассчитывали и выражали в lgТЦД50/мл (десятичных логарифмах 50%-ных тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмана-Кербера [2].
Культура клеток. Определение токсичности и противовирусной активности грибных экстрактов в монослое перевиваемой линии клеток MDCK, полученных из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», проводили как описано в [8].
Препарат сравнения. В качестве референс-препарата использовали Тамифлю® («Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.», Швейцария). Препарат вносили в культуральную среду через 1 ч после адсорбции вируса на клетках. Конечная концентрация в среде культивирования была подобрана предварительно и составляла 100 мг/мл. Мышам Тамифлю® вводили 2 раза в сутки перорально в дозе 10 мкг/г массы в объеме 0,2 мл сразу после заражения и далее в течение 4 сут после заражения вирусом гриппа.
Лабораторные животные. В работе были использованы мыши Balb/c массой 14-16 г, полученные из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Мышей содержали на стандартном рационе с достаточным количеством воды, подвергали эвтаназии в соответствии с требованиями по гуманному содержанию и использованию животных в экспериментальных исследованиях [6].
Изучение токсичности экстрактов базидиальных грибов. Мышам перорально вводили экстракты базидиальных грибов Laetiporus sulphureus, Ganoderma applanatum и Inonotus obliquus в разных концентрациях в объеме 200 мкл/гол. 2 раза в день в течение 5 сут, после чего за мышами наблюдали в течение 2-х недель. В каждой группе было по 4 животных.
Изучение противогриппозного действия экстрактов в лечебной схеме на лабораторных мышах. Мышей инфицировали интраназально под легким эфирным наркозом при введении в обе ноздри суммарно 40 мкл штамма вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 10 ЛД50 (50%-ные летальные дозы in vivo). Мышам перорально вводили экстракты базидиальных грибов в максимальных концентрациях в объеме 200 мкл/гол. сразу после заражения вирусом гриппа и далее 2 раза в день в течение 4 сут. В каждой группе было по 14 животных. Определение концентрации ВГ в легких 4-х животных каждой группы проводили через 4 сут после заражения вирусом гриппа при титровании гомогенатов легких мышей в культуре клеток MDCK, рассчитывали по методу Спирмана-Кербера и выражали в lg ТЦД50/мл [2]. За остальными животными (по 10 мышей в каждой группе) из этого эксперимента вели наблюдение в течение 16 дней, учитывая их гибель. В конце эксперимента высчитывали процент гибели мышей, коэффициент защиты и среднюю продолжительность их жизни (СПЖ).
Статистическая обработка данных. При расчетах 50%-ной летальной дозы и титров вируса гриппа в биологических образцах использовали метод Спирмана-Кербера [2]. Для нескольких повторов определяли среднее значение показателя (M) и ошибку среднего (m), достоверность различия средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента [2].
Результаты и обсуждение
Водные экстракты, полученные из плодовых тел базидиомицетов Ganoderma applanatum (09-11), Laetiporus sulphureus (09-12) и склероция Inonotus obliquus (09-20, 09-24 и 09-26) с концентрациями сухого вещества 4,11; 9,67; 17,33; 20,17 и 11,50 мг/мл соответственно, были приготовлены как описано в таблице 1.
Таблица 1
Получение экстрактов базидиальных грибов
|
№ п/п |
Номер образца |
Наименование гриба, вид биомассы |
Способ получения экстрактов грибов |
Масса сухого вещества, мг/мл |
|
1. |
09-11 |
Ganoderma applanatum, плодовое тело |
15 г измельченного на кофемолке сырья суспендировали в 240 мл стерильной дистиллированной воды (1:17), выдержали на водяной бане в течение 20 мин, после остывания профильтровали через капроновый фильтр и ткань, отжали |
4,11 |
|
2. |
09-12 |
Laetiporus sulphureus, плодовое тело |
200 г измельченного на кофемолке замороженного плодового тела суспендировали в 400 мл стерильной дистиллированной воды (1:2) и выдержали на кипящей водяной бане в течение 30 мин., освободили от осадка фильтрованием через капроновый фильтр и ткань, отжали |
9,67
|
|
3. |
09-20 |
Inonotus obliquus, природный склероций |
5 г измельченного природного сырья чаги после механохимической обработки * с 5% карбоната натрия на мельнице PM-1 до частиц размером 70-80 мкм суспендировали в 100 мл стерильной дистиллированной воды (1:20) и выдержали в термостате при температуре 50 °С в течение 24 ч, освободили от осадка центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин |
17,33 |
|
4. |
09-24 |
Inonotus obliquus, природный склероций |
5 г измельченного природного сырья чаги после механохимической обработки * с 5% карбоната натрия на мельнице PM-1 до частиц размером 70-80 мкм суспендировали в 100 мл стерильной дистиллированной воды (1:20) и выдержали в термостате при температуре 50 °С в течение 48 ч, освободили от осадка центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин |
20,17 |
|
5. |
09-26 |
Inonotus obliquus, природный склероций |
5 г природного сырья чаги, измельченного на мельнице IKA MF-10 до частиц размером 2 мм, суспендировали в 100 мл стерильной дистиллированной воды (1:20) и выдержали в термостате при температуре 50 °С в течение 48 ч, освободили от осадка центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин |
11,50 |
Примечание: *- разработка Института химии твердого тела и механохимии СО РАН
Первичный скрининг противовирусной активности экстрактов базидиальных грибов в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) был проведен в культуре клеток MDCK. Показано, что все исследованные экстракты в нетоксичных концентрациях подавляют репликацию вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) (индексы нейтрализации (ИН) вируса гриппа составляли от 4,0 до 5,5 lg ТЦД50) (таблица 2).
Таблица 2
Противовирусная активность экстрактов базидиомицетов в культуре клеток MDCK, инфицированных штаммом вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1)
|
Опытные и контрольные образцы |
Концентрация образцов по сухому веществу in vitro (мг/мл) |
Инфекционность вируса в культуре клеток MDCK (ИД50 в lg ТЦД50/мл) |
Индекс нейтрализации ИД50 контроль - ИД50 опыт (lg) |
|
(09-11) Ganoderma applanatum |
1,4 |
2,5 |
5,0 |
|
(09-12) Laetiporus sulphureus |
3,2 |
2,5 |
5,0 |
|
(09-20) Inonotus obliquus |
0,2 |
3,5 |
4,0 |
|
(09-24) Inonotus obliquus |
2,0 |
2,5 |
5,0 |
|
(09-26) Inonotus obliquus |
3,8 |
2,0 |
5,5 |
|
Тамифлю® |
0,1 |
2,0 |
5,5 |
|
Контроль без препарата |
- |
7,5 |
0 |
Наибольшим индексом нейтрализации вируса гриппа обладал экстракт (09-26) Inonotus obliquus, приготовленный из измельченных на кофемолке частиц гриба до диаметра 2 мм, который подавлял инфекционность вируса in vitro на 5,5 lg. Противовирусная активность этого экстракта была сравнима с таковой для коммерческого противогриппозного препарата Тамифлю (таблица 2). И хотя для достижения аналогичного для Тамифлю® противовирусного эффекта потребовалась большая (в 38 раз) концентрация грибного экстракта, состоящего из нескольких биологически активных веществ (БАВ), концентрация индивидуального БАВ, ответственного за противовирусное действие, в составе этого экстракта может быть меньше эффективной концентрации Тамифлю®. По сравнению с экстрактом (09-26) противовирусная активность еще двух экстрактов (09-20 и 09-24) на основе этого же гриба, приготовленных с использованием механохимической технологии получения микрочастиц гриба с диаметром 70-80 мкм, была незначительно ниже. Так, по сравнению с экстрактом (09-26) ИН экстракта (09-20) был ниже на 1,5 lg при концентрации, в 19 раз меньшей, а ИН экстракта (09-24) был ниже всего на 0,5 lg при концентрации, в 1,9 раза меньшей (таблица 2). Противовирусная активность экстрактов, полученных на основе других базидиомицетов Ganoderma applanatum (09-11) и Laetiporus sulphureus (09-12), была также незначительно ниже (на 0,5 lg) при более высоких их концентрациях (1,4 и 3,2 мг/мл соответственно) по сравнению с Тамифлю® и при более низких концентрациях по сравнению с экстрактом (09-26) (таблица 2).
В дальнейших экспериментах на лабораторных животных мы исследовали токсичность и способность грибных экстрактов подавлять продукцию вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в легких у инфицированных мышей (таблица 3). Исследование на лабораторных мышах, как описано в разделе Материалы и методы, токсичности экстрактов грибов Ganoderma applanatum, Laetiporus sulphureus и Inonotus obliquus в разных концентрациях не обнаружило токсических свойств этих экстрактов.
Таблица 3
Титр вируса гриппа (ВГ) A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в легких у мышей через 4 сут после инфицирования при пероральном введении грибных экстрактов или Тамифлю в сравнении с контролем (лечебная схема)
|
Опытные и контрольные образцы |
Суточная доза сухого вещества образцов (мкг/г массы мыши) |
Титры ВГ (в lgТЦД50/мл, M±m) в легких инфицированных мышей, получавших препараты (n=4) |
|
(09-11) Ganoderma applanatum |
55,6 |
6,05±0,17# |
|
(09-12) Laetiporus sulphureus |
129,0 |
5,00±0,18*# |
|
(09-20) Inonotus obliquus |
234,5 |
6,10±0,17# |
|
(09-24) Inonotus obliquus |
273,0 |
4,05±0,05*# |
|
(09-26) Inonotus obliquus |
155,6 |
6,05±0,13# |
|
Тамифлю® |
20,0 |
3,15±0,16* |
|
Контроль без препарата |
- |
6,33±0,20# |
Примечание: * - достоверное отличие от контрольной группы (p≤0,05); # - достоверное отличие от показателей у мышей, получавших Тамифлю® (p≤0,05); М - среднее, m - ошибка среднего; n - число животных.
Изучение способности грибных экстрактов подавлять продукцию ВГ в лечебной схеме показало, что через 4 сут после заражения достоверное снижение титра вируса в легких по сравнению с контрольной группой наблюдали в группах у мышей, получавших экстракты Laetiporus sulphureus (09-12) и Inonotus obliquus (09-24) и Тамифлю® (снижение концентрации вируса в легких животных при введении экстрактов и Тамифлю® составило 1,0; 1,95 и 2,85 lg соответственно) (таблица 3).
В дальнейших исследованиях нами были использованы наиболее показательные критерии защиты животных от вирусной инфекции - выживаемость, коэффициент защиты и средняя продолжительность жизни (СПЖ) мышей в опыте и контроле после их заражения высокопатогенным вирусом гриппа птиц. Установлено, что по всем трем показателям защитный эффект на инфицированных мышах обнаружили только два грибных экстракта Laetiporus sulphureus (09-12) и Inonotus obliquus (09-24). При этом экстракт (09-24) обнаружил наибольший противовирусный эффект, который был сравним с таковым для коммерческого противогриппозного препарата Тамифлю® (таблица 4).
На основании полученных данных установлено, что исследованные водные экстракты базидиальных грибов Ganoderma applanatum, Laetiporus sulphureus и Inonotus obliquus подавляют размножение высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в культуре клеток MDCK и в легких лабораторных мышей. Наибольший противовирусный эффект in vivo наблюдается для двух экстрактов Laetiporus sulphureus (09-12) и Inonotus obliquus (09-24). Наблюдаемое нами отличие противовирусных эффектов in vivo экстрактов (09-20), (09-24) и (09-26), полученных на основе одного и того же гриба Inonotus obliquus, может быть связано с различными технологиями приготовления этих экстрактов. Поскольку для интенсификации процесса экстрагирования важна степень измельченности сырья [7], а также длительность процесса извлечения БАВ, нами проведена оценка противовирусного эффекта грибных экстрактов Inonotus obliquus, приготовленных из плодового тела гриба с разной степенью измельченности и при разной длительности процесса экстрагирования. В результате проведенных исследований установлено, что предпочтительнее был процесс экстрагирования при 50 °С в течение 48 ч по сравнению с 24 ч, а степень измельченности грибного сырья - до частиц диаметром 70-80 мкм по сравнению с частицами диаметром 2000 мкм.
Таблица 4
Противовирусная активность экстрактов грибов в экспериментах на мышах, инфицированных 10 ЛД50 вируса гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), в лечебной схеме
|
Группы мышей, получавших экстракты грибов и контрольный препарат |
Суточная доза сухого вещества образцов (мкг/г массы мыши) |
Показатели выживаемости мышей, зараженных 10 ЛД50 вируса гриппа |
||
|
Количество и (%) выживших |
Коэффициент защиты (КЗ) |
СПЖ (сут) M±Sm |
||
|
09-11 (n=10) |
55,6 |
1 (10%) |
1,7% |
9,20±2,57 |
|
09-12 (n=10) |
129,0 |
3 (30%) |
21,7% |
11,40±3,47 |
|
09-20 (n=10) |
234,5 |
1 (10%) |
1,7% |
9,00±2,62 |
|
09-24 (n=10) |
273,0 |
5 * (50%) |
41,7% |
13,00±3,33 & |
|
09-26 (n=10) |
155,6 |
1 (10%) |
1,7% |
8,90±2,69 |
|
Тамифлю (n=12) |
20,0 |
7 * (58,3%) |
50,0% |
13,58±3,12 & |
|
Контроль ВГ без препаратов (n=12) |
- |
1 (8,3%) |
- |
8,92±2,57 |
Примечание: коэффициент защиты (КЗ)=% гибели в контроле -% гибели в опыте; * - отличие от контроля по критерию χ2 при p≤0,05; & - отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при р<0,006; СПЖ рассчитывали, принимая за максимальный срок жизни выживших животных 16 сут; M - среднее, Sm - стандартное отклонение; n - число животных.
В целом противовирусное действие исследованных грибных экстрактов может быть обусловлено активностью какого-то одного биологически активного вещества (БАВ): полисахарида, белка, тритерпена и др. или активностью композиций нескольких БАВ.
Заключение
Водные экстракты, выделенные из высших базидиомицетов, обладающие противовирусным эффектом в отношении высокопатогенного вируса гриппа птиц (субтип A/H5N1) на перевиваемой линии клеток MDCK и лабораторных мышах, могут быть использованы в качестве основы при разработке препаратов против гриппа.
Рецензенты:
Рябчикова Е.И., д.б.н., профессор, руководитель группы микроскопических исследований, ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск.
Белявская В.А., д.б.н., профессор, заведующая сектором отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирская область, п. Кольцово.