Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ СОВМЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ И ПРОБИОТИКОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Сизенцов А.Н. 1 Карпова Г.В. 1 Володченко В.Ф. 1 Тимофеева А.А. 1
1 ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный университет»
В статье представлены данные по изучению эффективности совместного применения пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиком в отношении S. еnteritidis. В ходе проведения экспериментов in vitro были установлены родовая устойчивость бактерий рода Bacillus к цефтазидиму, азтреонаму, колистину и видовая устойчивость B. cereus к пенициллину, B. subtilis 534 к хлорамфениколу; B. licheniformis ВКПМ В 7048 и B. subtilis ВКПМ В 7038 к цефотаксиму. При определении антибиотикопродуктивности было установлено, что наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ происходит на третьи сутки культивирования исследуемых штаммов микроорганизмов. В ходе определения аддитивного эффекта исследуемых пробиотических штаммов с антибиотиками установлено, что в отношении возбудителя сальмонеллезной инфекции эффективными являются комплексы B. subtilis 534 с пенициллином, а также B. licheniformis ВКПМ В 7048 и B. subtilis ВКПМ В 7038 с цефотаксимом, B. cereus с пенициллином.
Bacillus
антибиотики
споробактерин
Ветом
бактисубтил
аддитивный эффект
1. Бондаренко В.М. Механизм действия пробиотических препаратов / В.М. Бондаренко, Р.П. Чупринина, М.А. Воробьева // БИОпрепараты. – 2003. – № 3. – С. 2-5.
2. Воробьев А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Микробиология. – 2001. – № 6. – С. 102-105.
3. Дроздова Е.А. Резистентность пробиотических штаммов микроорганизмов к антибиотикам / Е.А. Дроздова, Н.В. Щербакова // Вестник ветеринарии. – 2013. – № 3 (66). – С. 25-27.
4. Захаренко С.М. Антибиотики, пробиотики, пребиотики: друзья или враги? / С.М. Захаренко, А.Н. Суворов // Consilium Medicum. – 2009. – № 8. – С. 21-29.
5. Сизенцов А.Н. Методы определения антибиотикопродуктивности и антибиотикорезистентности. Методические указания к лабораторному практикуму. – Оренбург, 2009. – 107 с.
6. Ellermeier C.D. A Three-protein Signaling Pathway Governing Immunity to a bacterial cannibalism toxin / C.D. Ellermeier, E.C. Hobbs, J.E. Gonzalez-Pastor, R. Losick // Cell. – 2006. – V. 124. – № 10. – P. 549-559.
7. Saarela M. Gut bacteria and Health foods-the European perspective / M. Saarela, S. Crittenden, N. Salminen, T. Mattila-Sandholm // International J. Food Microbiology. – 2002. – V. 78. – № 5. – P. 99-117.

Микробиоценоз пищеварительного тракта человека составляет более 500 видов микроорганизмов, при этом их количество в различных отделах желудочно-кишечного тракта неодинаково и варьирует в широком диапазоне. Наиболее многочисленными представителями нормофлоры кишечника являются Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., E. coli, Bacterioides sp., Clostridium sp., анаэробные стрептококки и другие микроорганизмы. Микрофлора ЖКТ участвует в процессах переваривания и всасывания, обеспечивает трофику кишечника, синтез витаминов, антиинфекционную защиту [1; 7].

Экзогенные и эндогенные факторы могут оказывать существенное влияние на качественный состав кишечной нормофлоры, что в свою очередь не только нарушает течение физиологических процессов, но и способствует развитию тяжелых патологических состояний. Количественное и качественное изменение состава кишечной нормофлоры называют дисбактериозом кишечника. Наиболее распространенной причиной развития дисбактериоза является антимикробная химиотерапия, оказывающая прямое антагонистическое действие на представителей нормофлоры и существенно изменяющая «микробный пейзаж» пищеварительного тракта. В связи с этим при лечении антибиотиками и другими антимикробными препаратами рационально назначение пробиотических лекарственных средств во время проведения антибактериальной химиотерапии.

Успехом комплексного применения антибиотика и пробиотика является субэффективная концентрация антимикробного препарата в пищеварительном тракте и определенная резистентность пробиотического штамма к АМП. Пероральный прием антимикробного препарата дает возможность использования временного интервала, что в свою очередь позволяет назначать пробиотический препарат после снижения концентрации антибиотика в просвете кишечника до минимальных значений. Помимо этого, возможно использование сведений о резистентности пробиотических штаммов к АМП [2; 4; 6].

Также необходимо учитывать, что эффективность комплексной терапии повышается в том случае, если и пробиотический штамм и антибиотик являются синергистами, так как их совместное действие снижает частоту появления побочных эффектов этиотропной терапии и повышает эффективность эрадикационной. Таким образом, совместное применение антибиотиков и пробиотиков позволит снизить риск развития дисбактериоза или уменьшить его тяжесть.

Исходя из выше перечисленного перед нами была поставлена следующая цель исследования: определение эффективности совместного применения пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus с антибиотиками.

Объектами наших исследований являлись чистые культуры пробиотических штаммов микроорганизмов: Bacillus subtilis 534 (из биопрепарата «Споробактерин»), Васillus сеrеus IР 5832 (из биопрепарата «Бактисубтил»), а также были получены отдельные чистые культуры Васillus subtilis ВКПМ В 7038 и Васillus licheniformis ВКПМ В 7048, входящие в состав «Ветом 2».

Для определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, нами использовались следующие методы: метод определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus с применением тест-систем Bio Merieux; диско-диффузионный метод (ДДМ) определения антибиотикорезистентности; метод последовательных разведений [5].

Для определения антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, нами использовались следующие методы: метод определения антибиотикопродуктивности микроорганизмов на твердых питательных средах (метод агаровых блочков); метод определения антибиотикопродуктивности микроорганизмов при культивировании их в жидких питательных средах (метод с агаровыми лунками) [5].

Оценку эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков определяли по следующей схеме (рисунок 1).

Рис. 1. Схема определения влияния антибиотика и пробиотика на подавление тест-организма в отдельности и совместно

Чашки Петри с МПА засеяли сплошным «газоном» тест-организмами (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis). Затем с помощью пробойника сделали три лунки (диаметр 6 мм) и внесли: в первую 30 мкл фильтрата, инкубированного 72 часа + 30 мкл физраствора, во вторую – 30 мкл антибиотика определенной концентрации, к которому условно-патогенные микроорганизмы оказались умеренно чувствительными + 30 мкл питательного бульона, а бактерии рода Bacillus – устойчивы, а в третью лунку – 30 мкл фильтрата + 30 мкл антибиотика, для того чтобы определить их влияние друг на друга.

Первоначальным этапом нашего исследования было определение антибиотикорезистентности пробиотических препаратов («Споробактерин», «Бактисубтил», «Ветом 2») на основе бактерий рода Bacillus с применением тест-систем Bio Merieux и ДДМ.

Критерием отбора антибиотиков для ДДМ, к которым исследуемые штаммы микроорганизмов проявляли резистентность, послужило определение антибиотикочувствительности с использованием тест-систем Bio Merieux, чтобы отобрать антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus устойчивы, а тест-организмы – умеренно чувствительны. В соответствии с данным методом было установлено, что все четыре штамма бактерии рода Bacillus оказались устойчивы к пенициллину, оксациллину, тикарциллину, мециллинаму, цефуроксиму, цефтазидиму, цефлулодину, цефиксиму, цефотаксиму, имипенему, линкомицину, хлорамфениколу, азтреонаму и колистину.

S.еnteritidis оказалась умеренно чувствительна к пенициллину, ко всем антибиотикам из группы аминогликозидов, к цефуроксиму, цефокситину, цефоперазону, цефиксиму, цефотаксиму и хлорамфениколу.

На следующем этапе антибиотикорезистентность проверяли ДДМ с использованием стандартных дисков, содержащих антибиотики (табл.1).

Таблица 1

Сравнительная таблица по антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus, входящих в состав пробиотиков, с применением ДДМ (мм)

Антибиотики

Исследуемые тест-организмы

Bsubtillis 534

Bcereus

5832

Blichenoformis ВКПМ В 7048

Bsubtillis

7038

S. еnteritidis

1

2

3

4

5

8

Penicilline

25,0±0,58

R

R

21,7±0,33**

20,7±0,67**

Ampicilline

26,0±0,58

17,7±0,33***

30,7±0,67

24,3±0,33*

25,7±0,67

Oxacilline

30,3±0,33

14,7±0,33***

26,0±0,58**

22,0±0,58***

R

Streptomycine

25,3±0,33

34,0±0,58

32,0±0,58

32,0±0,58

18,3±0,33***

Kanamycine

27,0±0,58

20,7±0,67**

25,0±0,58

25,0±0,58

22,0±0,58**

Gentamicine

35,0±0,58

30,3±0,88*

29,7±0,33**

29,3±0,33**

23,7±0,33***

Netilmicine

33,3±0,33

34,0±0,58

26,0±0,58***

32,3±0,88

21,3±0,67***

Cefalexine

35,0±0,58

29,7±0,33**

29,7±0,33**

32,3±0,67*

29,3±0,33**

Cefotaxime

36,3±0,67

20,0±0,58***

R

R

12±0,33***

Cefasoline

30,7±0,67

32,7±0,33

32,3±0,33

30,3±0,88

32,0±1,00

Cefixime

20,0±0,58

R

R

15,0±0,58**

29±1.76

Меропенем

34,0±0,58

32,0±0,58

29,3±0,67

35,3±0,33

30,0±0,58**

Imipeneme

45,7±0,67

38,0±1,15**

41,3±0,67*

41,0±0,58**

22,0±0,58***

Aztreonam

R

R

R

R

R

Vancomycine

21,3±0,88

17,7±0,33*

18,7±0,67

16,7±0,67*

22,7±0,33

Tetracycline

25,3±0,33

21,3±0,33**

22,7±0,33**

26,3±0,33

22,0±1,15*

Lincomycine

20,0±0,58

18,0±0,58

21,0±0,58

25,7±0,67

13,3±0,67**

Clindomycine

26,7±0,67

29,3±0,67

27,0±0,58

28,0±0,58

R

Erythromycine

33,0±0,58

28,3±0,88*

26,0±0,58**

30,3±0,33*

R

Chlorampheni-kol

R

22±0,91

24±0,58

27±0,17

13±0,21

Colistine

R

R

R

R

16,7±0,67

R – устойчивость к антибиотикам; * Р < 0,050; ** Р < 0,010; *** Р < 0,001.

 

По результатам ДДМ B. licheniformis 7048 и B. subtilis 7038 оказались устойчивыми к цефотаксиму, азтреонаму, а Bcereus и B. licheniformis еще и к пенициллину, а Bsubtillis 534 устойчив к хлорамфениколу. Все четыре штамма бактерии рода Bacillus проявили чувствительность к аминогликозидам, тетрациклинам, линкозамидам, макролидам. Полученные результаты полностью соответствуют результам, полученным Дроздовой Е.А. и Щербаковой Н.В. при изучении резистентности пробиотических штаммов микроорганизмов к антибиотикам [3].

Наиболее устойчивым является штамм Bcereus 5832, поскольку дает наименьшие зоны подавление антибиотиками, а Bsubtillis 534 более чувствителен к антибиотикам, так как для него характерны наибольшие зоны подавления роста. S. еnteritidis как тест-организм является устойчивой ко многим антибиотикам.

Исходя из проведенных предварительных исследований нами были отобраны те антибиотики, к которым бактерии рода Bacillus оказались устойчивыми (Пенициллин и «Бактисубтил»; Цефотаксим и «Ветом 2» Хлорамфеникол и «Cпоробактерин»), а S. еnteritidis умеренно чувствительна.

Следующим этапом было определение минимально подавляющих концентраций (МПК) изучаемых антибиотиков на рост исследуемых микроорганизмов. с этой целью мы использовали метод последовательных разведений (табл. 2).

Таблица 2 

Определение МПК пенициллина, цефотаксима, хлорамфеникола методом последовательных разведений

Исследуемые объекты

Антибиотик

Разведение антибиотиков

1:1

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1:512

Концентрация, ЕД

1 млн

500 тыс.

250 тыс.

125 тыс.

62,5 тыс.

31,25 тыс.

15,63 тыс.

7,81 тыс.

3,9 тыс.

1,95 тыс.

B. cereus

Пенициллин

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

S. etnteritidis

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

Концентрация, г

5

2,5

1,25

0,63

0,32

0,16

0,08

0,04

0,02

0,01

B. licheniformis ВКПМ В 7048

Цефотаксим

-

-

-

-

-

+

+

+

+

+

B. subtilis 7038

-

-

-

-

-

-

+

+

+

+

S. etnteritidis

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

B. subtilis 534

Хлорамфеникол

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

S. etnteritidis

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

 

Анализ ряда разведений растворов антибиотиков позволил определить концентрации, которые оказывают бактерицидное и бактериостатическое действие на исследуемые микроорганизмы, а также концентрации, которые не оказывают влияния на рост.

Для решения второй задачи нами проводились исследования по изучению антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus, в ходе которых была выявлена их антагонистическая активность относительно тест-организмов.

В первую очередь мы попытались определить, на какие сутки происходит наибольшая выработка антибиотикоподобных веществ в питательную среду. Для этого мы использовали метод с агаровыми лунками. Бактерии рода Bacillus выращивали в питательном бульоне в течение 48, 72 и 96 часов. В дальнейшем опыте использовали фильтрат от бактерий, по результатам которого установили, что максимальная выработка антибиотикоподобных веществ осуществляется через 72 часа культивирования микроорганизма. Это можно объяснить ростом популяции бактерий и конкуренцией за питательные компоненты среды.

Изначально антибиотикопродуктивность бактерий рода Bacillus изучили при их культивировании на твердых питательных средах с использованием метода агаровых блочков (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительная таблица по антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus методом агаровых блочков 

Название

штамма

B.subtillis 534

B.cereus IP 5832

B.lichenoformis ВКПМ В 7048

B.subtillis ВКПМ В 7038

S. enteritidis

26,0±0,58

22,7±0,33

23,3±0,33

24,3±0,67

 

Дальнейшие исследования по определению антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus проводили при культивировании на жидких питательных средах методом агаровых лунок и методом наложения дисков, пропитанных антибиотиками. Данные по зонам подавления тест-организма Salmonella enteritidis методом агаровых лунок представлены в табл. 4.

Таблица 4

Сравнительный анализ антибиотикопродуктивности бактерий рода Bacillus

методом агаровых лунок

Название

штамма

B.subtillis 534

B.cereus IP 5832

B.lichenoformis ВКПМ В 7048

B.subtillis ВКПМ В 7038

S. enteritidis

11,0±0,58

8,7±0,33

10,3±0,33

9,3±0,67

 

Анализ экспериментальных данных (табл. 4) свидетельствует о том, что выраженной антагонистической активностью в отношении тест-организмов обладает штамм B. subtillis 534, а наименее выраженной - B. cereus. Зона подавления роста тест-организмов находится в прямой зависимости от концентрации вырабатываемых антибиотических соединений бактериями рода Bacillus. При применении метода с наложением дисков также были получены диаметры зон подавления роста тест-организмов, были получены аналогичные результаты.

Эффективность совместного использования антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus. В этом случае можно установить явление синергизма (или аддитивность), когда происходит суммация антагонистического действия антибиотиков и пробиотиков, что имеет большую практическую значимость. Также можно зарегистрировать либо негативный эффект (антагонизм), когда антибиотикоподобные вещества, вырабатываемые бактериями, могут блокировать мишени действия антибиотиков, либо отсутствие какого-либо эффекта.

В связи с этим, учитывая результаты определения антибиотикорезистентности бактерий рода Bacillus к антибиотикам, мы провели опыт по изучению эффективности совместного действия антибиотических препаратов и пробиотических штаммов на условно-патогенные микроорганизмы (рис. 2).

Рис. 2. Метод по совместному применению антибиотика и пробиотика на основе бактерий рода Bacillus: 1 – фильтрат, 2 – антибиотик, 3 – антибиотик + фильтрат

На рис. 2 показан результат совместного применения антибиотика цефиксима (левый рисунок) и B. cereus при подавлении Salmonella enteritidis, пенициллина (правый рисунок) и B. lichenoformis ВКПМ В 7048 при действии на Salmonella enteritidis.

Далее представлена обобщающая табл. 5 по эффективности совместного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus.

Представленные в табл. 5 данные позволяют нам выделить пару антибиотик и пробиотик, которая подавляет тест-организм Salmonella enteritidis in vitro и, следовательно, дальнейшее использование этой пары in vivo при лечении сальмонеллеза.

Таблица 5

Экспериментальная оценка эффективности комплексного применения антибиотиков и пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus

Штамм

Salmonella enteritidis

Пенициллин

Цефотаксим

Хлорамфеникол

B. subtillis 534

Н

Н

А

B. cereus IP 5832

А

Н

О

B. licheniformis ВКПМ В 7048

А

А

Н

B. subtillis ВКПМ В 7038

Н

А

О

Примечание: А – аддитивный эффект, Н – негативный эффект, О – отсутствие эффекта

 


Библиографическая ссылка

Сизенцов А.Н., Карпова Г.В., Володченко В.Ф., Тимофеева А.А. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ СОВМЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ И ПРОБИОТИКОВ В УСЛОВИЯХ IN VITRO // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 3. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26374 (дата обращения: 02.12.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074