Заболеваемость меланомой кожи колеблется от ~1 до 55 случаев на 100 тыс. человек в год, в зависимости от географического положения, поведенческих особенностей и расовой принадлежности изучаемой популяции.Индивидуальный риск развития данной патологии в странах с преимущественно белым населением составляет 2%. В онкодерматологиина меланомуприходится 4% от общего числа новообразований, и она является причиной около 80% летальных исходов от онкологических заболеваний. Меланома кожи – одна из наиболее агрессивных форм солидных опухолей, которая характеризуется устойчивостью к стандартной химиотерапии. В связи с этим, 5-летняя выживаемость больных с метастатическим процессом меланомы кожи не превышает 10-15%[7].В странах с преимущественно белым населением меланома входит в первую десятку наиболее социально значимых категорий опухолей, как в отношении заболеваемости, так и смертности [7]. Меланома кожи является этиологически гетерогенным заболеванием, и ее развитие зависит как от генетических, так и от факторов внешней среды.  Различают наследственную и спорадическую формы. Частота спорадической меланомы составляет около 90%, а наследственной – 5-10%[2]. В молекулярном патогенезе спорадической меланомы основную роль играют онкогены и гены-супрессоры различных сигнальных каскадов.  В подавляющем большинстве случаев меланомы кожи  наблюдается гиперактивация  сигнального пути  RAS-RAF-MEK-MAPK,регулирующего клеточное деление, дифференцировку и метастазирование[3]. Одним из его ключевых звеньевслужитсерин-треониноваякиназа, кодируемая геном BRAF. Мутации в генеBRAF проявляются в 40-80% случаев меланомы кожи. На сегодняшний день известно около 40 соматических мутаций в генеBRAF[5].Наиболее часто встречаемой является активирующая точковая мутация T1799A (V600E), приводящая к замене валина на глутаминовую кислоту в 600 аминокислотном остатке соответствующего полипептида,частота которой составляет около 80-90% среди всех мутаций в генеBRAF [4]. Кроме того, c частотой до 20% от всех случаев выявляется мутация V600K, приводящая к замене валина на аспарагин [6].

Целью настоящего исследованияявляется определениемутационного статусагена BRAF, в зависимости от клинико-морфологических особенностей меланомы кожиу пациентов Юга России.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 52 пациента Юга России и Северного Кавказа: 22 мужчины и30 женщинв возрасте до 55 лет с морфологически подтвержденным диагнозом меланома кожи.Для молекулярно-генетического исследования использовали 3 мкм срезы парафиновых блоков (FFPE), содержащих не менее 20% опухолевых клеток. Экстракция ДНК включала стандартную процедуру депарафинирования в орто-ксилоле, лизис в 2% SDS- буфере в присутствии протеиназы K и дополнительную очистку от ингибиторов на колонках QIAamp® DNA FFPE TissueKit (QIAGENE, Germany).Для проведения ПЦР концентрацию ДНК нормализовывали до величины 2 нг/мкл. Полимеразная цепная реакция для 15 экзона гена проводилась с использованием пары праймеров5’-TGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’ и 5’-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3’. Амплификация проводилась на программируемом термоциклереMaxyGeneGradient (Axygen) по программе, включавшей: первичную денатурацию при 95оС – 5 минут и 40 циклов в режиме: денатурация - 95оС – 15 сек., отжиг – 66оС-15 сек., синтез при 72оС - 20 сек. и заключительная элонгация 72оС – 30 мин.Секвенирование проводилось по стандартному протоколу для набора ABIPrismBigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKits на амплификатореMaxyGeneGradient (Axygen) по следующей программе: первичная денатурация при 96оС – 1минута и 30 циклов в режиме: денатурация - 96оС – 10 сек., отжиг - 50оС - 5 сек., синтез при 72оС-4 мин.

Определение последовательности нуклеотидов образцов проводили на секвенатореABIPrism 3500(LifeTechnologies, USA).

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием непараметрического критерия c2для порогового уровня p<0.05.

Результаты и обсуждение

Для изучения мутационного статуса гена BRAFв зависимости от клинико-морфологических характеристик меланомы кожи больные были разделены на 2 группы: с мутацией вгенеBRAF - mtBRAF (n=26) и без мутации - wtBRAF (n=26).В результате проведенного исследования была определена общая частота проявления соматической мутации V600E в генеBRAF, которая составила 47% (24/51 пациентов), что согласуется с данными, полученными ранее в исследованиях [1].При исследовании мутационного статуса гена BRAF в объединенной группе мужчин и женщин с меланомой кожи были обнаружены следующие мутации:p.V600E(92%), характеризующаяся нуклеотидной заменойT на A в положении 1799, в результате чего происходит замена аминокислоты валина на глутаминовуюкислоту в положении 600. Мутация p.V600K (4% от общего количества мутаций), характеризующаяся заменойдвух нуклеотидов GTна AAв положении 1798-1799 и приводящая к замене аминокислоты валина на аминокислоту аспарагин в положении 600.Мутация p.V600 K601>E(4% от общего количества мутаций), характеризующаяся делецией трех нуклеотидов TGAв положении 1799-1801 и сдвигом рамки считывания.

 

Как показали результаты нашего исследования (Табл. 1), в группе пациентов с размером опухолей Т1частота встречаемости дикого типагенаBRAFстатистически достоверно была более чем в три раза выше, чем mtBRAF(p=0,0001).

В группах пациентов с размером опухолей Т3 и Т4 количество пациентов с mtBRAF было ~на 20 % больше, чем с wtBRAF (Таблица 1), что может говорить в пользу высокой скорости деления клетокBRAFассоциированной меланомы кожи[1].

Таблица 1

Зависимость размера опухоли от мутационного статуса гена BRAF

	T1	T2	T3	T4
wt BRAF	77,8%	53,3%	38,5%	40%
mt BRAF	22,2%	46,7%	61,5%	60%

В группе пациентов с mtBRAFна 23%чаще, чем в группе wtBRAF встречалась толщина опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм (р=0,008).

Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев. (Табл. 2).

Таблица 2

Характеристика мутационного статуса гена BRAF в зависимости от клинико-морфологических особенностей

Показатели	wtBRAF	mtBRAF
Пол        Мужской        Женский	58%  (n=15 ) 42 % (n=11 )	42 % (n=11 ) 58 %  (n=15 )
Метастазы в ЛФУ                   Присутствуют                    Отсутствуют	0 %   100%(n=26 )	11,5 % (n=3 )   88,5% (n=23)
Толщина  по Бреслоу < 2 мм ≥ 2 мм	50%   ( n=13 )  50%   ( n=13 )	27% ( n=7 ) 73%(n=19 )

Также в группе мутациив генеBRAFна 16%чаще встречались у женщин (р=0,023),(Табл. 2).

Заключение

Таким образом, при проведении молекулярно-генетического скринингамутаций в 15 экзоне гена BRAF(секвенирование ДНКпо Сэнгеру) у 52 больных Юга России с меланомой кожи нами установлены три варианта мутаций в 15 экзоне гена BRAF: p.V600E, p.V600Kи V600 K601>E (мутация V600 K601>E впервые диагностирована на Юге России).BRAF мутациибыли обнаружены у 50% пациентов: p.V600E в 92%, p.V600K в 4% иV600 K601>Eв4% случаев. Усредненный показатель частоты мутаций V600E в 15 экзоне гена BRAF (для мужчин и женщин) составил 47%. Наблюдалось достоверное увеличение случаев частоты соматической мутации V600E в 15 экзоне гена BRAF у пациентов с толщиной опухоли по Бреслоу ≥ 2 мм на 23%.Метастазирование в регионарные лимфатические узлы наблюдалось лишь в группе с мутацией гена BRAF и встречалось в 11,5% случаев.

 

Рецензенты:

Франциянц Е.М.,д.б.н., профессор, руководитель лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ, г. Ростов-на-Дону;

Горошинская И.А., д.б.н.,профессор, главный научный сотрудник лаборатории изучения патогенеза злокачественных опухолей ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ,г. Ростов-на-Дону.