Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

КОПИЙНОСТЬ 17-ТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ У ПАЦИЕНТОВ С ДИАГНОЗОМ АДЕНОКАРЦИНОМА ЖЕЛУДКА

Водолажский Д.И. 1 Тимошкина Н.Н. 1 Маслов А.А. 1 Колесников Е.Н. 1 Татимов М.З. 1
1 ФГБУ «Ростовский Научно-Исследовательский Онкологический Институт» Минздрава РФ
Изменение числа копий участков ДНК (CNV), как полиморфизм генома, играет важную роль в канцерогенезе желудка. Целью настоящего исследования была оценка изменения относительной копийности 17-ти генетических локусов в образцах опухолевой и условно нормальной ткани желудка 47-ми пациентов с диагнозом аденокарцинома без признаков метастатического поражения регионарных лимфоузлов (n=18) и с регионарными метастазами (n=29). Согласно полученным данным выделены гены с редко встречающейся аберрантной копийностью (частота менее 10 %): (P35, MDM2, MET, S6K2<PIK3CA < IRX1 <AURKA), и гены с аберрантной копийностью с частотой встречаемости более 10 % (HER2<NFKB<C-MYC, POU5F1B<CCND1<OCT1<HV2). Для двух локусов (АРС и GKN1) не удалось выявить изменений числа копий в опухоли. Два ядерных локуса (NFKB и POU5F1B) продемонстрировали статистически значимые различия при дискриминации групп с локализованной и местнораспространенной формами рака желудка (OR=8,95, 95 % CI: 1,04-77,37, P<0,05). Таким образом, амплификация NFKB и POU5F1B генов может быть ассоциирована с развитием метастазов в регионарных лимфатических узлах.
изменение числа копий генов
аденокарцинома желудка
метастазы
1. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Гудуева Е.Н. Изменение копийности генетических локусов при раке желудка / О.И. Кит и [др.] // Молекулярная биология. – 2015. – Т.49. – № 4. – С. 658-666.
2. Корниенко И.В., Водолажский Д.И., Вейко В.П., Щербаков В.В., Иванов П.Л. Подготовка биологического материала для молекулярно-генетических идентификационных исследований при массовом поступлении неопознанных тел / И.В. Корниенко [др.]. – Ростов-на-Дону: ООО «Ростиздат», 2001. – C.256.
3. Ha S.Y., Lee J., Kang S.Y. et al. MET overexpression assessed by new interpretation method predicts gene amplification and poor survival in advanced gastric carcinomas // Modern Pathology. – 2013. – V.26. – P. 1632–1641. doi:10.1038/modpathol.2013.108.
4. Hayashi H., Arao T., Togashi Y. et al. The OCT4 pseudogene POU5F1B is amplified and promotes an aggressive phenotype in gastric cancer // Oncogene. – 2015. – V.34 (2). – P.199-208. doi: 10.1038/onc.2013.547.
5. Janjigian Y.Y., Tang L.H., Coit D.G. et al. MET expression and amplification in patients with localized gastric cancer // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. – 2011. – V. 20. – P. 1021–1027.
6. Labots M., Buffart T.E., Haan J.C. et al. High-level copy number gains of established and potential drug target genes in gastric cancer as a lead for treatment development and selection. Cell Oncol 2014; 37: 41–52.
7. Liang L., Fang J-Y., Xu J. Gastric cancer and gene copy number variation: emerging cancer drivers for targeted therapy // Oncogene. 2015. V.35. P. 1475-1482. doi:10.1038/onc.2015.209.
8. Mauro J.A., Butler S.N., Ramsamooj M., Blanck G. Copy number loss or silencing of apoptosis-effector genes in cancer // Gene. – 2015. – V. 554. – P. 50–57.
9. Scatena R. Mitochondria and cancer: a growing role in apoptosis, cancer cell metabolism and dedifferentiation // AdvExp Med Biol. – 2012. – V.942. – P.287-308.
10. Shlien A., Malkin D. Copy number variations and cancer // Genome Medicine. – 2009. – N1- 62.
11. Sonoda A., Mukaisho K., Nakayama T. et al. Genetic lineages of undifferentiated-type gastric carcinomas analysed by unsupervised clustering of genomic DNA microarray data // BMC Med Genomics. – 2013. – V. 6. – P. 25.
12. Takuji G., Yanagisawa A., Sasako M. et al. Incidence in lymph node metastasis from early gastric cancer: estimation with a large number of cases at two large centers // Gastric Cancer. – 2000. – V.3. – P. 219-225.
13. Wang X., Liu Y., Shao D. et al. Recurrent amplification of MYC and TNFRSF11B in 8q24 is associated with poor survival in patients with gastric cancer // Gastric Cancer. – 2016. – V.19 (1). – P.116-27. doi: 10.1007/s10120-015-0467-2.
14. Wu C-S., Chen M-F., Lee I-L., Tung S-Y. Predictive Role of Nuclear Factor-κB Activity in Gastric Cancer: A Promising Adjuvant Approach With Caffeic Acid Phenethyl Ester // Journal of Clinical Gastroenterology. – 2007. – 41(10): 894-900.
15. Yoon J.H., Choi W.S., Kim O., Park W.S. The role of gastrokine 1 in gastric cancer // J Gastric Cancer. – 2014. – V.14 (3). – P. 147-55. doi: 10.5230/jgc.2014.14.3.147.

Варьирование числа копий участков ДНК человека (Copynumbervariation – CNV) относится к одному из видов полиморфизма, встречающемуся в нормальных клетках в процессе дифференцировки и функционирования, и затрагивающего, по меньшей мере, 10 % генома. Исследования последних лет свидетельствуют о важной роли аберрантных изменений CNV в онкогенезе [10]. Накопление CNV-событий в онкотрансформированных клетках может служить селективным фактором преимущества по сравнению с нормальными клетками тканей. В ряде работ были выявлены потери проапоптотических генов в образцах раковых опухолей желудка и одновременно противоположный процесс – амплификация генов, связанных с ростом, делением и метастазированием [1, 8].

Всё больше фактов свидетельствует о том, что CNV могут стать информативными биомаркерами для ранней диагностики рака желудка, последующего контролирования течения заболевания и эффективности терапии, а также служить маркерами таргетной химиотерапии. Кроме того, предложено использовать CNV для молекулярного субтипирования рака желудка [6, 7]. Не менее важной задачей является поиск прогностических маркеров метастазирования, так как метастазы возникают у 80–90 % больных раком желудка, при этом выживаемость составляет 65 % в случае ранней диагностики заболевания и менее 15 % на поздних стадиях процесса [12].

Цель настоящего исследования заключалась в изучении числа копий генетических локусов в неопластических опухолях желудка, как без признаков метастатического поражения регионарных лимфатических узлов, так и с метастазами в них. Относительную копийность (RCQ) определяли для 16-ти генов ядерной локализации – участников ключевых сигнальных путей, регулирующих рост клетки, выживание, метастазирование и устойчивость к химиотерапии, и некодирующего локуса митохондриальной ДНК (HV2), потеря копийности которой является наиболее распространенным событием при неоплазиях различной локализации.

Материалы и методы

Клиническим материалом для исследования относительной копийности генов служили ткани (опухолевые и условно здоровые) 47-ми пациентов Юга России с гистологически подтвержденным диагнозом аденокарциномы G2-G3 (Таблица 1), проходивших плановое лечение в ФГБУ «РНИОИ» МЗ РФ. Медиана возраста составила 67 лет (от 36 до 83 лет). Образцы тканей были получены в процессе хирургического вмешательства в период с 2015 по 2016 г. Все пациенты, вошедшие в данное исследование, имели ECOG статус от 1 до 2. Для работы с биоптатами пациентов были получены добровольные информированные согласия, в соответствии с этическим регламентом проведения медико-биологических исследований.

По клинической классификации заболевания были сформированы две группы пациентов: группа T3-4N0M0 с локализованной формой опухоли (n=18) и группа T3-4N1-2M0 с местнораспространенной формой рака желудка (n=29). Для верификации образцов тканей проводилось стандартное патолого-морфологическое исследование с окрашиванием фиксированных срезов гематоксилин-эозином. Биоптаты тканей после проведения патолого-морфологического исследования классифицировали на две группы: опухолевые (малигнизированные) и контрольные (не малигнизированные) образцы.

Таблица 1

Клинико-морфологическая характеристика пациентов

Характеристика

Переменные

Количество (%)

Клиническая классификация

T3-4N0M0

18 (38%)

T3-4N1-3M0

29 (62%)

Стадия дифференцировки опухоли (G)

2

24 (51%)

2-3

12 (26%)

3

11 (24%)

Пол

женщины

14 (30%)

мужчины

33 (70%)

Возраст, лет

<60

11 (23%)

>60

36 (77%)

 

Геномную ДНК экстрагировали из свежезамороженных операционных биоптатов тканей желудка с использованием лизирующего SDS-содержащего буфера в присутствии протеиназы-К и последующей фенол-хлороформной экстракцией [2]. Концентрацию полученных препаратов ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.0® (Invitrogen, США) с использованием набора Quant-iT™ dsDNAHigh-Sensitivity (HS) AssayKit (Invitrogen, США).

Для определения дозы гена (RCQ) проводили ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Прямые и обратные праймеры были разработаны с использованием соответствующих референсных последовательностей NCBI GenBank в программе Primer-BLAST. Каждые 25 мкл ПЦР-смеси содержали 10 нг геномной ДНК, 0,2mM dNTP’s, по 600 нМ прямого и обратного праймеров, 2,5 mM MgCl2, ПЦР-буфер, 0,05u/µl ДНК-полимеразы Thermusaquaticus («Синтол», Россия). В качестве красителя использовали EvaGreen (Biotium, США). Амплификацию каждой из проб осуществляли в трех повторностях. Количественную RT-qPCR проводили с использованием термоциклера CFX96 (Bio-Rad, США) в соответствии с инструкциями производителя по следующей программе: 95 °C 3 мин., и 40 циклов при 95 °C 10 сек, 58 °C 30 секунд (чтение оптического сигнала FAM для красителя EvaGreen) и 72 °C 15 секунд. Первичные данные RT-qPCR получали с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager (ver. 2.1). Генетический локус GAPDH использовали в качестве референсного для нормализации полученных показателей количественной RT-qPCR.

Относительную копийность генетического локуса (RСQ) рассчитывали по формуле 2-ΔCt. Дозу исследованного локуса считали равной диплоидному набору (2n), если отношение RCQопухоль/норма ~1. Если отношение RCQопухоль/норма было > 1,5 или< 0,5, дозу локуса считали увеличенной (>3n) или уменьшенной (<1n), соответственно.

Статистический анализ проводили с помощью непараметрических критериев в программах Statisticav.7 и SPSSStatistics 19.

Результаты исследования и их обсуждение

Для всех вошедших в исследование пациентов были получены данные по копийности 17-ти генетических локусов. В целом, 33 образца неоплазий желудка (70 %) продемонстрировали амплификацию и/или потерю хотя бы по одному локусу. Среднее значение локусов амплифицированных и/или с потерей в группе T3-4N0M0 (без регионарных метастазов) составило 1,06+0,83 на одного пациента, а в группе T3-4N1-3M0 (с регионарными метастазами) – 2,14+2,2.

Выявлено аберрантное изменение RCQ 14-ти исследованных генов хромосомной локализации, за исключением АРС и GKN1 (рисунок 1).

Рис. 1. Частота амплификаций и потерь 16-ти генетических локусов в образцах аденокарциномы желудка

Потеря копийности зафиксирована для двух генов-онкосупрессоров (IRX1 и p53). Напротив, для 11-ти онкогенов было характерно увеличение относительной копийности, тем не менее в одном образце опухоли с регионарными метастазами была отмечена потеря копийности локуса CCND1, кодирующего белок циклин D1. Наиболее частыми CNV-изменениями в образцах аденокарциномы желудка стало уменьшение копийности локуса мтДНКHV2 в 15-ти случаях (32 %), кроме этого в трёх случаях HV2 был амплифицирован по сравнению с неопухолевой тканью желудка (рисунок 1).

Распределение случаев аберрантного изменения RCQ по локусам в исследованной выборке в зависимости от ряда клинико-патологических показателей приведено в таблице 2.

Таблица 2

Клинико-морфологические характеристики и частота аберрантных RCQ в исследованных локусах

Локус

Возраст

Пол

 

G

N-классификация

<60, (%)

>60, (%)

P*

мужчины, (%)

женщины, (%)

P

G2, (%)

G2-3, (%)

P

N0, (%)

N1-3, (%)

P

c-myc

1(9)

8(22)

0,595

6(18)

3(21)

0,883

2(8)

7(30)

0,056

1(6)

7(24)

0,099

p53

0

1(3)

0,526

1(3)

0

0,655

1(4)

0

0,982

0

1(3)

0,807

mdm2

0

1(3)

0,526

1(3)

0

0,655

0

1(4)

0,983

0

1(3)

0,807

nfkb

1(9)

7(19)

0,734

7(21)

1(7)

0,453

3(13)

5(22)

0,649

0

7(24)

0,047

aurka

1(9)

2(6)

0,775

2(6)

1(7)

0,607

0

3(13)

0,070

0

3(10)

0,425

ccnd1

2(18)

8(22)

0,893

10(30)

0

0,053

5(21)

5(22)

0,779

4(22)

6(21)

0,808

her2

2(18)

4(11)

0,921

3(9)

3(21)

0,490

4(17)

2(9)

0,703

1(6)

5(17)

0,433

hv2

5

13(36)

0,838

13(39)

5(36)

0,928

8(33)

10(44)

0,678

8(44)

10(35)

0,708

irx1

2(18)

3

0,713

4(12)

1(7)

0,991

2(8)

3(13)

0,959

1(6)

4(14)

0,405

met

0

1(3)

0,526

1(3)

0

0,655

1(4)

0

0,982

0

1(3)

0,807

pik3ca

1(9)

3(8)

0,890

3(9)

1(7)

0,724

1(4)

3(13)

0,570

1(6)

3(10)

0,480

pou5f1b

1(9)

10(28)

0,382

9(27)

2(14)

0,626

3(13)

8(35)

0,074

1(6)

10(35)

0,045

s6k2

1(9)

1(3)

0,956

2(6)

0

0,879

0

2(9)

0,451

0

2(7)

0,692

oct1

4(36)

8(22)

0,585

11

1(7)

0,129

6(25)

6(26)

0,803

4(22)

8(28)

0,947

N

11

36

 

33

14

 

24

23

 

18

29

 

Примечание: * – вероятность в χ2-тесте.

Статистический анализ данных выявил тенденцию влияния пола на частоту изменения числа копий гена ccnd1 (р=0,053), все 10 случаев аберрантных RCQccnd1 были определены у мужчин. В качестве тенденции также определена ассоциация амплификации двух локусов aurka и pou5f1b с низкой степенью дифференцировки (G3) опухоли (Р=0,070 и Р=0,074, соответственно). Дискриминация групп с локализованной формой опухоли (T3-4N0M0) и местнораспространенной формой рака желудка (T3-4N1-3M0) возможна по двум исследованным ядерным локусам nfkb и pou5f1b 2= 5,10 и 5,18, соответственно, Р<0,05). В группе T3-4N1-3M0 частота амплификации гена nfkb составила 24 %, гена pou5f1b – 34 %, тогда как в группе T3-4N0M0 изменений RCQ локуса nfkb не было зафиксировано, а амплификация pou5f1b отмечена в 6 % опухолей (OR=8,95, 95 %CI: 1,035-77,37, P<0,05). Потенциально для идентификации местнораспространенной формы рака желудка возможно использование ещё одного онкогена c-myc, амплификация которого также преобладала в группе T3-4N1-3M02=2,72, Р=0,099).

Корреляционный анализ полученных данных выявил статистически достоверные ассоциации между амплификацией трёх локусов c-myc, nfkb, pou5f1b и метастазированием в региональные лимфоузлы (р=0,026; 0,009; 0,009, соответственно), а также степенью дифференцировки опухоли (р=0,042; 0,014;0,016, соответственно).

Отметим, что в группе T3-4N1-3M0 статистически достоверно коррелировала амплификация генов C-MYCи POU5F1B (R=0,609, р<0,01), локализованных рядом на 8q24 хромосоме.

Ранее нами обсуждалось снижение числа копий митохондриальной ДНК (мтДНК), оцениваемое по RCQ локуса HV2, в различных гистологических типах рака желудка относительно нормальных клеток и по мере потери дифференцировки опухоли [1]. Тенденция снижения числа копий мтДНК, как отражение известного эффекта Варбурга – перехода малигнизированных клеток в режим преимущественного использования гликолиза [9], отражена и в настоящем исследовании, однако данный маркер не дискриминировал опухоли с метастазами в регионарные лимфоузлы. Тем не менее частота снижения числа копий HV2 в группе с локализованной формой опухоли составила 44 % против 28 % в группе с местнораспространенной формой рака желудка. Кроме того, в последней присутствовали два случая амплификации локуса HV2. Полученная тенденция согласуется с описанным повышением копийности мтДНК в опухолевых тканях у пациентов с метастазами, что может отражать особенности энергетического метаболизма, переводящей клетки в аэробный режим для обеспечения их распространения из первичного очага в другие органы [9].

Одной из основных задач исследования CNV генома является выявление нарушения баланса онкогенов и онкосупрессоров, которые вызывают функциональные нарушения в клетке, способствующие её малигнизации. Согласно литературным данным охарактеризованы изменения копийности множества генов в опухолях различного происхождения. Отметим однако, что оценки встречаемости изменения копийности одного и того же гена часто значительно разнятся. Так, приводимые частоты амплификации онкогена HER2, ассоциированного, как правило, с плохим прогнозом заболевания, варьируют от 6 до 23 % от числа исследованных случаев рака желудка [7]. Вклад в вариативность оценок, по-видимому, могут вносить как методы и схема исследования, так и популяционная принадлежность пациентов. Например, в двух недавних работах методами PCR-RT и FISН оценивалась копийность другого онкогена MET, который считают перспективным в качестве мишени для таргетной терапии при раке желудка. Относительно высокая частота амплификации гена MET (21,8 %) была определена группой Haetal. [3], исследовавших пациентов этнических корейцев (n=495). В работе Janijisiaetal. [5], изучавших пациентов западных регионов США (n=38), амплификации MET не было обнаружено, несмотря на повышенную экспрессию мРНК и белка в 63 % и 50 % случаев, соответственно.

В нашей работе не были идентифицированы образцы опухолей с аберрантной копийностью генов APC и GKN1, что может быть обусловлено и недостаточной численностью выборки для идентификации редких событий, и популяционным составом выборки пациентов (европеоиды), а также ограничениями при формировании групп сравнения (отбирали опухоли с инвазией всех слоев желудка – Т3-4). Экспрессия гена GKN1, недавно идентифицированного мощного супрессора опухоли желудка, значительно падает в большинстве метаплазий и раковых опухолях [15]. Однако механизмы негативной регуляции активности GKN1 изучены недостаточно, рассматривается участие в этом процессе, как уменьшение копий гена, так и инактивирующие мутации и гиперметилирование промотора.

В целом, выявленные нами частоты аберрантных RCQ в злокачественных опухолях желудка T3-4N0-3M0 в большинстве случаев согласуются с данными более ранних исследований. Условно генетические локусы, вошедшие в настоящую работу, можно разделить на группу, показатели аберрантной относительной копийности которых редко изменяются при малигнизации (частота менее 10 %), такие как – P35, MDM2, AURKA, IRX1, MET, PIK3CA, S6K2, и на группу, показатели RCQ которых чаще изменяются при малигнизации тканей желудка, такие как – C-MYC, NFKB, CCND1, HER2, HV2, POU5F1B, OCT1.

Два из 17-ти исследованных локусов продемонстрировали статистическую значимость для дискриминации групп T3-4N0M0 и T3-4N1-3M0-NFKB (чувствительность Se-88 %; специфичность Sp – 45 %) и POU5F1B(Se-91 %; Sp – 47 %); в отношении локуса C-MYC наблюдалась тенденция влияния на риск образования метастазов (чувствительность Se-78 %; специфичность Sp – 44 %). Ранее сообщалось о значительном увеличении числа копий гена с-Мyс в процессе канцерогенеза [11], в том числе была показана тесная связь этого события с глубиной метастазов в лимфатических узлах и инвазией опухоли желудка [13]. Для гена POU5F1B с ещё не вполне описанными функциями была продемонстрирована связь увеличения числа копий и избыточной экспрессии при раке желудка, что в свою очередь, коррелировало с ростом опухоли [4]. Биологическое значение активации ядерного фактора-каппа-B (NF-kappaB) в неопластических образованиях желудка человека неясно. Тем не менее была выявлена ассоциация активации NF-kappa B с канцерогенезом, агрессивностью опухоли желудка и инфекцией H.pylori с повышенной экспрессией MMP-9, IL-1beta и IL-8 [14].

В целом, обнаружение в опухоли желудка амплификации по одному из трёх описанных выше маркеров и/или изменение RCQ более чем по двум ядерным локусам, оцененным в настоящей работе, повышает риск метастазирования в регионарные лимфатические узлы в 6,9 раз (OR=6,933; 95 % CI:1.3-35.3; Se – 87 %, Sp – 52 %).

Заключение

Относительная копийность исследованных генетических локусов в опухолях желудка разных N-типов изменяется не одинаково. Для аденокарцином T3-4N1-3M0, в отличие от аденокарцином T3-4N0M0, характерна амплификация онкогенов NFKB и POU5F1B.


Библиографическая ссылка

Водолажский Д.И., Тимошкина Н.Н., Маслов А.А., Колесников Е.Н., Татимов М.З. КОПИЙНОСТЬ 17-ТИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЛОКУСОВ У ПАЦИЕНТОВ С ДИАГНОЗОМ АДЕНОКАРЦИНОМА ЖЕЛУДКА // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 3.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=26405 (дата обращения: 20.11.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074