Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Власов Р.В. 1 Каде А.Х. 2 Барышев М.Г. 1 Трофименко А.И. 2 Шашков Д.И. 1 Туровая А.Ю. 2 Романовский К.А. 1 Башинский А.Е. 2 Гончарова Е.Н. 2 Уварова Е.А. 2 Пишкина А.Ю. 2 Черкесова Д.Р. 2

---

1 ФГБОУ ВО Кубанский государственный университет

2 ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России

Исследуемые наночастицы серебра получены с помощью метода кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления ионов серебра. По данным электронной микроскопии они имеют сферическую форму и средний размер 12,5±2,5 нм. Результаты масс-спектрометрии свидетельствуют, что 30-дневное употребление раствора наносеребра 5 мг/л приводит к росту его содержания в почках (в 94 раза), в головном мозге (58 раз), в тонком кишечнике (32,5 раз), в селезенке (21,8 раз), в печени (15,6 раз) и в сердце (4,4 раза) крыс. ЭПР-спектроскопия показывает, на фоне значительного накопления серебра в организме крыс, содержание свободных радикалов в головном мозге (на 22,6%), печени (на 29,5 %) и сердце (на 88,1%) снижается, в тонком кишечнике достоверных различий в содержании радикалов не выявлено, а в селезенке (на 92,3%) и почках (на 51,3%) оно возрастает. Таким образом, употребление крысами раствора с концентрацией наносеребра 5 мг/литр и средним размером частиц 12,5 ± 2,5 нм при свободном спаивании в течение 30 дней приводит к значительному накоплению серебра во внутренних органах и разнонаправленным изменениям оксидативного статуса.

Статья в формате PDF

195 KB

серебро

наночастицы

эпр-спектроскопия

масс-спектрометрия

свободно-радикальное окисление

крыса

1. Власов Р.В. Оптимизация физико-химических условий, используемых для получения наночастиц серебра // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 2-7. – С. 1397-1400.

2. Басов А.А. Устройство для получения наночастиц серебра патент на полезную модель // Патент России №150504. – 16.06.2014.

3. Гмошинский И.В. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. III. Энзимологические, биохимические маркеры, состояние системы антиоксидантной защиты // Вопросы питания. – 2016. – Т. 85. – № 2. – С. 14-23.

4. Зайцева Н.В. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролиджоном, в 92-дневном эксперименте на крысах. II. Морфология внутренних органов // Вопросы питания. – 2016. – Т. 85. – № 1. – С. 47-55.

5. Петрицкая Е.Н. К вопросу о токсичности наночастиц серебра при пероральном введении коллоидного раствора // Альманах клинической медицины. – 2011. – № 25. – С. 9-12.

6. Соседова Л.М. Оценка биологических эффектов воздействия наносеребра на ткань головного мозга экспериментальных животных // Медицина труда и промышленная экология. – 2015. – № 4. – C. 26-30.

7. Трофименко А.И. β-эндорфин и цитокиновый профиль в динамике экспериментального ишемического инсульта // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 6; URL: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=16368 (дата обращения: 26.12.2016).

8. Шумакова А.А. Токсикологическая оценка наноразмерного коллоидного серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном. I. Характеристика наноматериала, интегральные, гематологические показатели, уровень тиоловых соединений и апоптоз клеток печени // Вопросы питания. – 2015. – Т. 84. – № 6. – C. 46-51.

9. Ahlberg S. PVP-coated, negatively charged silver nanoparticles: A multi-center study of their physicochemical characteristics, cell culture and in vivo experiments // Beilstein J. Nanotechnol. – 2014. – V. 5. – P. 1944-1965.

10. Al Gurabi M.A. In vivo DNA damaging and apoptotic potential of silver nanoparticles in Swiss albino mice // Onco Targets and Therapy. – 2015. – V. 8. – P. 295-302.

11. Antsiferova A. Extremely low level of Ag nanoparticle excretion from mice brain in in vivo experiments // Materials Science and Engineering. – 2015. – V. 98. – P.1-6.

12. Arora S. Interactions of silver nanoparticles with primary mouse fibroblasts and liver cells // Toxicol Appl. Pharmacol. – 2009. – V. 236. – P. 310-318.

13. Chorley B. The cellular and genomic response of rat dopaminergis neurons (N27) to coated nanosilver // Neuro Toxicology. – 2014. – V. 45. – P. 12-21.

14. Costa C.S. In vitro effects of silver nanoparticles on the mitochondrial respiratory chain // Mol. Cel. Biochem. – 2010. – V. 342. – P. 51-56.

15. El Mahdy M.M. Evaluation of hepatotoxic and genotoxic potential of silver nanoparticles in albino rats // Experimental and toxicologic pathology. – 2015. – V. 67(1). – P. 21-29.

16. Elle Ebabe R. Dietary exposure to silver nanoparticles in Sprague–Dawley rats: Effects on oxidative stress and inflammation // Food Chem. Toxicol. – 2013. http://dx.doi.org/10.1016/j.fct.2013.07.071.

17. Gaillet S., Rouanet M.J. Silver nanoparticles: their potential toxic effects after oral exposure and underlying mechanisms – a review // Food and Chemical Toxicology. – 2015. http://dx.doi.org/doi: 10.1016/j.fct.2014.12.019.

18. Gaiser B.K. Effects of silver nanoparticles on the liver and hepatocytes in vitro // Toxicological sciences. – 2013. – V. 131(2). – P. 537-547.

19. Haase A. Effects of silver nanoparticles on primary mixed neural cell cultures: uptake, oxidative stress and acute calcium responses // Toxicological sciences. – 2012. – V. 126(2). – P. 457-468.

20. Hendrickson O.D. Toxicity of nanosilver in intragastric studies: biodistribution and metabolic effects // Toxicology Letters. – 2016. – V. 241. – P. 184-192.

21. Jemec A. An interlaboratory comparison of nanosilvercharacterisation and hazard identification: harmonising techniques for high quality data // Environment International. – 2016. – V. 87. – P. 20-32.

22. Jiao Z.H. Hormesis effects of silver nanoparticles at non-cytotoxic doses to human hepatoma cells // PLoS ONE. – 2014. – V. 9(7): e102564. DOI: 10.1371/journal.pone.0102564.

23. Kim Y.S. Subchronic oral toxicity of silver nanoparticles. // Particle and Fibre Toxicology. – 2010. – V. 7. – P. 7-20.

24. Lee T.Y. Bioenergetic failure correlates with autophagy and apoptosis in rat liver following silver nanoparticle intraperitoneal administration // Particle and Fibre Toxicology. – 2013. – V. 10. P. 10-40.

25. Mc Shan D., Ray C.P., Yu H. Molecular toxicity mechanism of nanosilver // J. Food Drug Anal. – 2014. – V. 22(1). – P. 116-127.

26. Munger A.M. Assessing orally bioavailable commercial silver nanoparticle product on human cytochrome P450 enzyme activity // Nanotoxicology, Early Online: 1–8. DOI: 10.3109/17435390.2014.948092.

27. Munger A.M. In vivo human time-exposure study of orally dosed commercial silver nanoparticles // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 2013. DOI:10.1016/j.nano.2013.06.010.

28. Patlolla A.K., Hackett D., Tchounwou B.P. Silver nanoparticle induced oxidative stress-dependent toxicity in Sprague-Dawley rats // Mol. Cell Biochem. – 2015. – V. 399(0). – P. 257– 268.

29. Rooney R. Determination of silver in animal tissues by a wet-oxidation process followed by atomic-absorption spectrophotometry // Analyst. – 1975. – V. 100. – P. 471-475.

30. Shahare B., Yashpal M., Singh G. Toxic effects of repeated oral exposure of silver nanoparticles on small intestine mucosa of mice // Toxicol. Mech. Methods. – 2013. – V. 23. – P. 161–167.

31. Sharma K.V. Organic-coated silver nanoparticles in biological and environmental conditions: fate, stability and toxicity // Advances in Colloid and Interface Science. – 2014. – V. 204. – P. 15-34.

32. Sun C. Silver nanoparticles induced neurotoxicity through oxidative stress in rat cerebral astrocytes is distinct from the effects of silver ions // Neurotoxicology. – 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.neuro.2015.09.007.

33. Wang Z., Xia T., Liu S. Mechanisms of nanosilver-induced toxicological effects: more attention should be paid to its sublethal effects // Nanoscale. 2015. DOI: 10.1039/C5NR01133G.

Ввиду повсеместного применения наносеребро может рассматриваться как потенциальный загрязнитель окружающей среды [17, 31, 33]. Токсикологические свойства наносеребра весьма неоднозначны и значительно отличаются от таковых, в сравнении с солями серебра [20, 21, 25, 32]. Традиционно авторы изучают влияние на живые организмы высоких доз наносеребра, в основном при парентеральном или ингаляционном пути их введении [5, 20, 24, 25]. При этом недостаточно исследованы биоэффекты серебра при хроническом пероральном поступлении его в низких дозах, между тем именно такая ситуация становится наиболее вероятной при загрязнении им окружающей среды [5, 33].

Цель работы – изучить влияние хронического перорального употребления раствора наночастиц серебра с концентрацией 5 мг/л на выраженность процессов свободно-радикального окисления в организме крыс.

Материалы и методы исследования

Исследования на животных выполнены в лаборатории кафедры общей и клинической патологической физиологии ФГБОУ ВО КубГМУ МЗ РФ, а дальнейшее изучение полученного биоматериала проводилось на базе ФГБОУ ВО КубГУ. Эксперименты проведены на 24 белых нелинейных крысах-самцах средней массой 98±1,5 грамм. Эксперимент на животных продолжался с 20 октября по 18 ноября 2015 года. Крысы содержались в условиях 12 часового светового дня, постоянной комнатной температуры 25 ⁰С, свободного доступа к воде и корму. Содержание животных и постановка экспериментов проводились в соответствии с международными правилами «Guide for the Careand Use of Laboratory Animals».

Наноразмерное серебро синтезировано методом кавитационно-диффузионного фотохимического восстановления на базе ФГБОУ ВПО КубГУ [1, 2]. Исследуемый раствор наносеребра ежедневно получали путем разведения препарата в питьевой воде до рабочей концентрации 5мг/л.

Характеристика групп животных: группа № 1 (n=12) – контрольная, крысы получали в течение 30 суток питьевую воду; группа № 2 (n=12) – опытная, крысы получали на протяжении 30 дней питьевую воду с концентрацией наночастиц серебра 5мг/л. Разбивка крыс на группы проводилась случайным образом.

В ходе эксперимента ежедневно рассчитывалось количество серебра, поступившего в организм крысы за сутки из расчета на 1 килограмм массы тела (Дсут – суточная доза), с последующим определением его суммарного потребления за 30 дней из расчета на 1 килограмм массы тела (Дк – курсовая доза). Взвешивание крыс в ходе эксперимента проводилось ежедневно.

Спустя 30 дней (завершение эксперимента), крысы обеих групп подвергались эвтаназия путем декапитации, предварительно животные вводились в золетил-ксилазиновый наркоз [7]. У трупа проводился забор головного мозга, печени, почек, сердца, селезенки и тонкого кишечника.

Для визуализации и описания наночастиц серебра использован растровый электронный микроскоп JEOLJSM-7500F.

Содержание серебра во внутренних органах определяли методом масс-спектрометрии с использованием квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ThermoScientific – Xseries II (США), пробоподготовка проводилась по Rooney [29].

Оценку содержания свободных радикалов в органах проводили путем измерения спектров ЭПР на спектрометре JES FA300 (JEOL, Япония) в Х-диaпазоне. Условия измерения: СВЧ мощность 1 мBт, частота микроволнового излучения 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции 0,1 мТл. Образцы измеряли в кварцевой ампуле (5 мм), масса навески в зоне резонатора составляла 0,03 г.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программного обеспечения «Statistica 10 version» фирмы «StatSoftInc.». Данные взвешивания крыс и измерения размеров наночастиц серебра выражали путем расчета среднего (M) и стандартного отклонения (SD), в виде M±SD. Полученные результаты исследуемых групп после статистической обработки выражали в виде медианы (Me) с использованием 25 и 75 процентилей (p25 и p75). Для проверки гипотезы о гауссовом распределении показателей в исследуемых группах использовали критерий Шапиро – Уилка. В связи с тем, что распределение значений исследуемых показателей в группах отличалось от нормального, их сравнение проводилось по непараметрическому критерию Манна – Уитни (Utest), с установлением уровня значимости *p≤0,01.

Результаты и их обсуждение

В течение всего периода работы случаев выведения животных из исследования не было. При осмотре внешний вид и поведение крыс в группах № 1 и № 2 видимых отличий не имели. На момент окончания эксперимента средняя масса крыс в группе № 1 составила 148±8 грамм, а в группе № 2 – 150±6 грамм, при этом статистически значимых отличий между группами не выявлено (p≥0,01).

По данным электронной микроскопии наночастицы серебра имели сферическую форму и средний размер 12,5 ± 2,5 нм. В нашей работе мы сосредоточились на исследовании биологических свойств низких концентраций наносеребра при его хроническом пероральном поступлении в организм крыс, в условиях именно свободного спаивания его раствора (ситуация, по нашему мнению, наиболее приближенная к реальной). Дк за период исследования (30 дней) составила 8,2±0,96 мг/кг, что на порядок ниже в сравнении с работами аналогичного профиля [3-5, 8, 16, 23, 32].

Данные масс-спектрометрии показывают, 30-дневное употребление питьевой воды с концентрацией наночастиц серебра 5 мг/л приводит к статистически значимому (p=0,0001≤0,01), в сравнении с контролем, увеличению содержания серебра во внутренних органах крыс из группы № 2. Содержание серебра возрастает в почках в 94 раза, головном мозге в 58 раз, тонком кишечнике в 32,5 раз, селезенке – 21,8 раз, печени – 15,6 раз, сердце в 4,4 раза крыс, что отражает выраженные кумулятивные свойства наночастиц серебра (табл. 1).

Таблица 1

Содержание серебра во внутренних органах крыс из групп № 1 и № 2

ЭПР-спектроскопия показывает, содержание свободных радикалов в головном мозге (на 22,6 %), печени (на 29,5 %) и сердце (на 88,1 %) снижается (p=0,0001≤0,01), в тонком кишечнике достоверно не меняется (p=0,0140≥0,01), а в селезенке (на 92,3 %) и почках (на 51,3 %) значительно возрастает (p=0,0001≤0,01) (табл.2).

К моменту окончания эксперимента содержание серебра в ткани мозга возрастает в 58 раз, но в то же время, по данным ЭПР-спектроскопии, содержание свободных радикалов в нем снижается практически на 22,6 %. Основываясь на полученных данных, можно сделать предположение о наличии антиоксидантных свойствах наносеребра. О значительных кумулятивных свойствах наноразмерного серебра в отношении ткани головного мозга было известно и ранее [11]. Однако в большинстве известных литературных источников описывается выраженный прооксидантный эффект наноразмерного серебра. Индукции реакций свободно-радикального окисления, а также активации апоптоза отводится ключевая роль в его нейротоксическом влиянии [6, 17].

Анализируя данные литературы, мы видим, что выводы о нейротоксичности серебра основываются преимущественно на результатах культуральных исследований [19, 32]. В частности показана дозозависимая способность наносеребра, вызывать нарушения в работе ферментов цепи переноса электронов [14]. В то же время известно, что митохондриальную дисфункцию вызывают лишь частицы серебра размером 75 нм, а более мелкие размером 10 нм напротив, запускают нейрональные стресс-протективные пути [13]. Показана способность наносеребра с размером частиц 70 нм к выраженной кумуляции в организме, а также их дозозависимые негативные эффекты на культурах клеток крыс и человека, выявлена значительная модификация негативных свойств серебра при взаимодействии с белками при in vivo применении [9].

Таблица 2

Концентрация парамагнитных центров во внутренних органах исследуемых крыс

Несмотря на то, что серебро из организма в основном выводится с калом, наибольшее его накопление отмечено для почек (рост в 94 раза), при этом содержание свободных радикалов в них также возросло на 51,3 %. Много серебра накапливалось в селезенке (рост в 21,8 раз), при этом содержание свободных радикалов в ней возросло на 92,3 %. Полученные результаты хорошо согласуются с описанными в литературных источниках [20, 28].

В настоящее время не существует единого мнения по вопросу влияния наносеребра на печень. Многие авторы показывают его токсичность, которая проявляется в виде активации процессов свободно-радикального окисления, некроза и апоптоза гепатоцитов, воспалительных изменений в паренхиме печени, а также увеличения содержания маркеров цитолиза в крови [10, 15-18, 23, 28]. Однако существуют исследования, отрицающие токсическое действие даже высоких доз наносеребра [20, 22, 27].

В нашей же работе содержание серебра в печени возрастает в 15,6 раз, что значительно уступает его содержанию в почках, головном мозге, тонком кишечнике и селезенке (табл.1), эту особенность можно объяснить высокой активностью процессов выведения серебра из печени [11, 20]. Содержание свободных радикалов в печени на этом фоне падает на 29,5 % (табл.2). Так как основным поставщиком радикалов в печени является микросомальная система окисления, то можно было бы предположить факт снижения их содержания ее угнетением, однако существуют исследования, отрицающие данную возможность [26]. В то же время имеются работы, показывающие, что наносеребро не только запускает реакции свободно-радикального окисления, но и выступает в качестве стимулятора экспрессии антиоксидантных ферментов [12].

В литературе известно явление выраженного нарушение функции эпителия тонкого кишечника у крыс при употреблении растворов наносеребра вследствие разрушения микроворсинок [30]. В нашей работе, несмотря на увеличение содержания серебра в кишечнике в 32,5 раз, мы наблюдали некоторое снижение содержания свободных радикалов, которое, однако, статистически достоверным не являлось.

К окончанию исследования содержание серебра в сердце крыс возрастало в 4,4 раза, а количество свободных радикалов, напротив, снижалось на 88,1 %, что показывает выраженные антиоксидантные свойства исследуемого раствора наносеребра, что в целом не соответствует данным литературы [16].

В зависимости от свойств наночастиц серебра, их дозировки, пути и способа применения меняется их проникающая и кумулятивная способность, а также динамика продукции ими ионов серебра, ответственных за его токсические эффекты. Этим объясняется наличие полярных воззрений на сущность биоэффектов, возникающих в организме животных и человека при хроническом пероральном употреблении растворов наносеребра [17, 22, 27, 28].

Заключение

30-дневное употребление крысами питьевой воды с концентрацией наносеребра 5 мг/л приводит к увеличению его содержания в почках в 94 раза, головном мозге в 58 раз, тонком кишечнике в 32,5 раз, селезенке 21,8 раз, печени 15,6 раз и сердце в 4,4 раз. По данным ЭПР-спектроскопии, мы видим, что содержание свободных радикалов в головном мозге на 22,6 %, печени на 29,5 % и сердце на 88,1 % ниже, в тонком кишечнике достоверных изменений не выявлено, а в селезенке на 92,3% и почках на 51,3% оно возрастает.

Таким образом, употребление крысами раствора с концентрацией наносеребра 5 мг/литр и средним размером частиц 12,5 ± 2,5 нм в течение 30 дней характеризуется значительным его накоплением во внутренних органах и разнонаправленными по выраженности изменениями активности процессов свободно-радикального окисления.

Библиографическая ссылка