Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТЕПСИНОВ ВО ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ КРЫС, КАК ИСТОЧНИКАХ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ПРОТЕАЗ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК ХРЯЩЕВОЙ И КОСТНОЙ ТКАНЕЙ

Воропаева А.А. 1 Голубинская П.А. 2 Садовой М.А. 1 Русова Т.В. 1
1 ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России
2 ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России
Моделирование патологических процессов на клетках является важным этапом изучения механизмов, приводящим к тем или иным нарушениям в соединительной ткани, где внеклеточный матрикс и лизосомальные протеазы играют существенную роль в межклеточных взаимодействиях. Использование катепсинов в исследованиях на клетках in vitro, продуцирующих большое количество внеклеточного матрикса, представляется перспективным для моделирования некоторых звеньев патологических процессов, происходящих в хрящевой и костной тканях. Сравнительное исследование активности этих ферментов в разных органах животных – необходимый этап в выборе источника выделения данных ферментов. Показано, что наибольшая активность катепсина B выявляется в селезенке крыс, а катепсинов L, S и D – в почке, поэтому при использовании более чем 2-х крыс, источником для выделения соответствующих ферментов могут быть селезенка и почка. Наименьшая активность всех исследуемых цистеиновых протеаз выявлена в печени и составляет 10–30 % активности от наибольшей активности, выявляемых в почке или селезенке. При использовании одного животного печень крыс из-за существенно большей массы по сравнению с другими органами больше подходит для экстракции ферментов, чем селезенка и почка.
катепсин b
катепсин l
катепсин s
катепсин d
печень
почки
селезенка
активность ферментов
крысы wistar
лизосомальные протеазы
дефекты кости
дефекты хряща
применение протеаз
1. Венедиктова А.А. Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс: автореф. дис. … канд. биол. наук. – Новосибирск, 2009. – 24 с.
2. Изменение активности катепсинов В, L и D в печени у крыс Wistar и преждевременно стареющих крыс OXYS разного возраста /А.А. Венедиктова, О.В. Фаламеева, Н.Г. Колосова и др. // Сибирский научный медицинский журнал. – 2007. – Т. 27, № 3. – С. 127-132.
3. Особенности метаболизма протеогликанов из разных топографических зон коленного сустава у больных остеоартрозом: вариабельность фенотипа хондроцитов /Т.В. Русова, Е.Л. Строкова, А.А. Воропаева, Е.И. Щелкунова // Сибирский научный медицинский журнал. – 2013. – Т. 33, № 5. – С. 78-86.
4. Фаламеева О.В. Роль протеиназ лизосом и их эндогенных ингибиторов при росте и химиотерапии опухолей у мышей: автореф. дис. … канд. мед. наук. – Новосибирск, 2002. – 28 с.
5. Cartilage macromolecules and the calcification of cartilage Matrix / A.R. Poole, Y. Matsui, A. Hinek, E.R. Lee // The anatomical record. – 1989. – Vol. 224. – P. 167-179.
6. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases / B.F. Becker, M. Jacob, S. Leipert et al. // Br. J.Clin. Pharmacol. – 2015. – Vol. 80(3). – P. 389-402.
7. Differences in cathepsin B mRNA levels in rat tissues suggest specialized functions / B.San Segundo, S.J.Chan, D.F. Steiner et al. // FEBS Lett. – 1986. – Vol. 201(2). – P. 251-256.
8. Distribution of basement membrane molecules, laminin and collagen Type IV, in normal and degenerated cartilage tissue / C. Bindzus, W.S. Toh, A.H. Gomoll et al. // Cartilage. – 2014. – Vol. 5(2). – P. 123–132.
9. Distribution of cathepsins B and H in rat tissues and peripheral blood cells /E. Kominami, T.Tsukahara, Y.Bando, N. Katunuma // J. Biochem. – 1985. – Vol. 98 (1). – P. 87-93.
10. Mason S.D., Joyce J.A. Proteolytic networks in cancer // Trends Cell. Biol. – 2011. – Vol. 21 (4). – P. 228-237.
11. Novinec M., Lenari B., Turk B. Cysteine Cathepsin Activity Regulation by glycosaminoglycans // BioMed. Research International. – 2014. – 9 p.
12. Olbricht C.J. Distribution of cathepsins B and L in the kidney and their role in tubular protein absorption // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. – 1992. – Vol. 30 (10). – P. 675-81.
13. Secreted cathepsin L generates endostatin from collagen XVIII / U. Felbor, L. Dreier, R.A.R. Bryant et al. // EMBO J. – 2000. – Vol. 19(6). – P. 1187–1194.
14. Specific catalytic activity of cathepsin S in comparison to cathepsins B and L along the rat nephron / Н. Schmid, M. Koop, S. Utermannet al. // Biol Chem. – 1997. – Vol. 378 (2). – P. 61-69.
15. Splenic cathepsin L is maturated from the proform by interferon-gamma after immunization with exogenous antigens / T. Zhang, Y. Maekawa, T. Sakai et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2001. – Vol. 283 (2). – P. 499-506.

Моделирование патологических процессов in vitro, происходящих при повреждении хрящевой и костной тканей, является важным этапом в выявлении и понимании патогенетических механизмов заболеваний, приводящих к формированию костных и хрящевых дефектов. Внеклеточный матрикс кости и хряща играет значительную роль в функционировании резидентных клеток. Установлено, что его компоненты влияют на клетки как прямо, так и опосредовано. Так, молекулы проколлагена II типа, синтезируемые клетками первичного регенерата в месте дефекта костной ткани, являются центрами кристаллизации, поскольку адсорбируют кальций на своих пропептидах, а также инициируют прорастание сосудов в зону дефекта, способствуя замещению первичного регенерата костным [5]. Не исключено, что отщепление пропептидов коллагена протеазами и элиминация их из матрикса может изменять скорость ангиогенеза и кальцификации в регенерате.

Протеогликаны (ПГ) в силу своих физико-химических свойств способны адсорбировать факторы роста, регулируя биосинтетическую или митотическую активность клеток [3], поэтому их производные, полученные в ходе ограниченного протеолиза, могут изменять их функциональные свойства. Существенному усилению скорости деградации белков катепсинами B, L и S способствуют гликозаминогликаны (ГАГ), которые наряду с коллагеном в составе ПГ составляют основу матрикса хряща и которые высвобождаются после расщепления белкового компонента ПГ протеазами в матриксе [11]. Было установлено, что при связывании с такими ГАГ, как гепарин, дерматансульфат, хондроитинсульфат С и гиалуронан, усиливается активность катепсина S против коллагена IV типа [13], входящего в состав перицеллюлярного матрикса хондроцитов. Кроме того, гепарин и гепарансульфат  стабилизируют структуру катепсина В, увеличивая период его активности в нейтральной и щелочной среде в 5 раз.

Существенную роль в ограниченном протеолизе, приводящему к изменению свойств молекул внеклеточного матрикса, отводят металлопротеазам. Однако протеазы лизосом помимо основной своей функции – деградации белков, участвуют в процессинге сигнальных молекул, таких, как факторы роста и цитокины [1, 4], осуществляя свою регуляторную роль в матриксе ткани. Кроме того, показано, что катепсин D обладает самостоятельным митогенным эффектом, не связанным с его протеолитическими свойствами [2]. Не исключено, что эффектами сигнальных молекул также обладают комплексы цистеиновых протеаз с их специфическими ингибиторами – цистатинами.

Известно, что катепсин B наряду с сериновыми протеазами, расщепляя гликопротеины гликокаликса клеток, приводит к нарушению прикрепления клеток матриксу, к потере гиалуронана вследствие расщепления связывающих его белков [6], что может быть весьма критичным для насыщенной гиалуронаном хрящевой ткани. Изменение передачи сигналов от молекул матрикса к клетке из-за расщепления ее рецепторов является  дополнительным эффектом действия катепсина B. Показано, что катепсин В способен инициировать апоптоз клеток [4, 10].

Катепсин L способен расщеплять многие белки матрикса, включая коллаген I типа, однако, с меньшей скоростью, чем катепсин K [1]. Его регуляторная роль показана на примере участия катепсина L в ангиогенезе при опухолевом росте, заключающаяся в альтернативном процессинге эндостатина [13]. Микроциркуляция является лимитирующим фактором в консолидации краев дефекта кости, поэтому не исключено, что катепсин L может принимать участие в этом процессе за счет стимуляции ангиогенеза.

Таким образом, лизосомальные протеазы представляют область повышенного интереса в патологии хрящевой и костной тканей. Получение этих протеаз из различных органов и тканей могло бы стать полезным при исследовании клеток хондроцитов и остеобластов invitro. Выделение катепсинов из лизосом составляет более простую задачу, чем выделение металлопротеаз, поскольку  вклад лизосомального протеолиза в общий катаболизм белка составляет 70 % [2]. Однако для выбора источника выделения лизосомальных протеаз необходимо исследовать активность данных ферментов в различных органах. Крысы широко применяются в лабораторных исследованиях, имеют существенную массу, и поэтому их органы могут быть использованы как источники лизосомальных ферментов.

В соответствии с изложенным выше, целью работы явилась оценка активности катепсинов B, L, D и S в различных внутренних органах крыс, как источниках лизосомальных протеолитических ферментов для исследования их влияния на клетки хрящевой и костной тканей.

Материалы и методы

Работа выполнена на 10-ти самках крыс Wistar в возрасте 3,5 месяцев массой 280–350 г. Животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Извлеченные печень, почку и селезенку промывали 0.25 М сахарозой с 1 мМ ЭДТА, рН 7.3. Кусочки органов гомогенизировали тефлоновым пестиком с помощью механического гомогенизатора с электрическим приводом в холодной сахарозе в соотношении 1:9 (w/v). Гомогенаты хранили при -20 °С не более 4-х недель. Перед определением активности гомогенаты разводили 0,2 % тритоном Х-100 в соотношении 1:1 (v/v).

Активность протеаз и концентрацию белка определяли согласно [2].

Активность катепсина В определяли в 0.1М фосфатном буфере, рН 6.0 с помощью 10 мкМ флуоресцентного субстрата Z-Arg-Arg-NMCA (НПО «Вектор», Россия).

Активность катепсина L определяли в 0.1М ацетатном буфере, рН 5.5 против 10 мкМ субстрата Z-Phe-Arg-NМСА (НПО «Вектор», Россия) в присутствии 1 нМ селективного ингибитора катепсина В CA-074 (любезно предоставлен профессором Кутунума, Япония).

Активность катепсина S определяли в 0.1 М фосфатном буфере, рН 6.5 с помощью 10 мкМ субстрата Z-Val-Val-Arg-МСА (Sigma, США) с добавлением 1 нМ СА-074и 1 мМфенилметилсульфонилфторида (Sigma, США) согласно. Реакционные смеси инкубировали 30 мин при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением раствора 0.1 М монохлоруксусной кислоты в 0.1 М ацетатном буфере рН 4.3. Флюоресцирующие продукты реакции измеряли при l 355нм (возбуждение) и l 460 нм (эмиссия) на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5301 (Япония). Удельную активность цистеиновых протеаз выражали в мкмольметилкумарилламида (МСА)/мин. на мг белка.

Активность катепсина D определяли в 0.1 М ацетатном буфере, рН 5.0 с добавлением 2 % азоказеина в 6 М мочевине равного объема, согласно. Реакцию останавливали 10 % раствором трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 мин, при 6000 об./мин определяли оптическую плотность супернатанта на спектрофотометре «Spekol 20» (KarlZeiss, Германия) при l 366 нм. Активность катепсина D выражали в условных лабораторных единицах в расчете на мг белка (Е 366 /час на мг белка).

Проверка нормальности распределения исследуемых признаков производилась по критерию Шапиро – Уилка. В целях установления значимости различий показателей между независимыми группами, данные которых не подчиняются нормальному закону, была проведена статистическая обработка с помощью критерия Крускала – Уолиса с учётом поправки Бонферони для трёх групп.

Результаты и обсуждение

Активность катепсинов зависела от органов, в которых она определялась (табл. 1).

Таблица 1

Активность протеаз в органах крыс, выраженная в ед. активности на 1 мг белка

 

Орган

Активность цистеиновых протеаз, мкМ МСА/мин. на 1 мг белка

Активность катепсина D, усл. лаб. ед./час на1 мг белка

Содержание белка, мг/г ткани

Масса органа, г

Катепсин В

Катепсин L

Катепсин S

Печень

0,207*

(0,177-0,261)

0,306**

(0,270-0,375)

0,568**

(0,474-0,667)

0,280**

(0,238-0,361)

220**

(200-236)

13 **

(12,39-13,6)

Селезенка

1,999*

(1,750-2,273)

0,455**

(0,432-0,503)

2,127**

(1,907-2,366)

0,312**

(0,085-0,152)

317,85**

(308,1-327,6)

0,915**

(0,72-1,01)

Почка

0,707*

(0,564-0,741)

0,642**

(0,539-0,719)

5,678**

(5,210-6,246)

0,484**

(0,385-0,733)

263,25**

(257,4-284,7)

1,28**

(1,2-1,31)

Данные представлены как медиана (межквартильный размах)

*p<0.01, **p<0.001 по сравнению с другими органами.

Наибольшая активность катепсина B в расчете на 1 мг белка была зарегистрирована в селезенке, превышающая активность фермента в почке более чем в 2 раза, а в печени – в 10 раз (табл. 1). Полученные данные о более высокой активности катепсина B в селезенке крыс, по сравнению с печенью, совпадают с данными других исследователей [9], изучавшими каталитическую активность ферментов, и данными коллектива [8], показавшим наибольшую экспрессию мРНКкатепсина В в селезенке и почках по сравнению с печенью. Однако это не является универсальной закономерностью даже среди животных одного вида: известно, что у мышей линии CBA активность катепсина B в печени превышает активность в селезенке 2 раза, при одинаковом содержании катепсина В, выявляемом с помощью иммуно-ферментного анализа [4]. Не исключено, что это может быть связано с большим количеством его ингибитора – стефина A в селезенке [4].

Активность катепсина L достигала наибольших значений в расчете на 1 мг белка в ткани почки, превышая активность в селезенке в 1.4, а в печени – в 2 раза.

Как и в случае с активностью катепсина L, наибольшие значения активности катепсина S наблюдали в почке. При этом в селезенке активность катепсина S относительно почки была ниже в 2.8 раз, а в печени – в 10 раз.

Вероятно, такие различия в активности ферментов в разных органах связаны с их специальными функциями: предполагают, что катепсины B, L и S в почках являются ключевыми ферментами в гетерофагоцитозе белков из ультрафильтрата [9, 14], в то время как функция катепсинов L и S в селезенке связана с процессингом антигенов [15]. Кроме того, катепсин L принимает значительное участие в деградации внеклеточного матрикса в лимфоидных органах, опосредуя, таким образом, миграцию лимфоцитов [4]. С этими фактами может быть связана более высокая активность катепсинов L и S в селезенке по сравнению с печенью.

Наибольшую активность катепсина D в расчете на 1 мг белка наблюдали в ткани почки, в которой она превышала активность катепсина D в селезенке в 1.5 раза, а в печени в 1.7 раз, несмотря на одинаковый уровень экспрессии катепсина D в изучаемых органах, согласно данным [7].

Таким образом, активность лизосомальных протеаз в печени в расчете на 1 мг белка была ниже, чем в других органах. Это может быть связано с тем, что печень состоит из функционально разных клеток, одни из которых – Купферовские клетки печени, являясь резидентными макрофагами, экспрессируют большее по сравнению с гепатоцитами количество лизосомальных протеаз [1], другие – гепатоциты, осуществляющую пластическую функцию, синтезируют один из важнейших ингибиторов протеаз широкого спектра действия – α2-макроклобулина [1]. Вероятно, это вносит свой вклад в инактивацию протеаз печени при приготовлении гомогената этого органа.

Известно, что активность катепсина D и исследуемых цистеиновых протеаз усиливается в опухолевой ткани за счет увеличения экспрессии. Однако данные о гетерогенности популяции опухолевых и часто наблюдающихся в геноме опухолевых клеток мутациях [4, 10] ставят перспективу получения протеаз из опухолевой ткани под сомнение, поскольку не исключено, что такие изменения могут затронуть и гены протеаз, а также отрицательно влиять на воспроизводимость выделения ферментов.

В исследуемых органах крыс количество белка также различалось, но в меньшей степени, чем активность протеаз: наименьшее содержание белка обнаруживалось в печени, в селезенке его количество было выше на 44 %, а в почке – на 19 % (Табл. 1).

При пересчете активности на 1 грамм органа оказалось, что различия в активности протеаз между органами стали более выраженными (Табл. 2). Это дало основание предполагать, что наилучший выход катепсина B можно ожидать из селезенки, катепсинов L, S и D – из почек.

Таблица 2

Активность протеаз в разных органах крыс, выраженная в ед. активности на 1 грамм органа

Орган

Активность цистеиновых протеаз, мкМ МСА/мин. на 1 г органа

Активность катепсина D, усл. лаб. ед./час на 1 г органа

Катепсин В

Катепсин L

Катепсин S

Печень

48 (43-52)*

65 (64-78)**

122 (103-144)*

64 (54-76)*

Селезенка

609 (572-709)*

141 (131-165)**

668 (590-775)**

43 (27-48)*

Почка

187 (158-209)*

182 (148-190)**

1542 (1459-1766)**

135 (108-194)*

 

Данные представлены как медиана (межквартильный размах)

*p<0.01, **p<0.001 по сравнению с другими органами.

Тем не менее, согласно данным (табл. 1), печень у крыс имеет наибольшую массу и поэтому при пересчете активности ферментов на целый орган оказалось, что при использовании органов от одного животного катепсины L и B предпочтительнее выделять из печени (табл. 3), а катепсин S – из почек. Из этих же соображений наиболее подходящим источником катепсина D также может служить печень. При отсутствии ограничений по количеству животных, имея возможность использовать более 2-х крыс, катепсины Lи S целесообразнее выделять из их почек, а катепсин B – из селезенки.

Таблица 3

Активность протеаз в разных органах крыс, выраженная в ед. активности на орган

 

Орган

Активность цистеиновых протеаз, мкМ МСА/мин. на орган

Активность катепсина D, усл. лаб. ед./час на орган

Катепсин В

Катепсин L

Катепсин S

Печень

630 (542-674) **

867 (738-1006)**

156 (134-180) **

810 (698-934)*

Селезенка

568 (513-653) **

123 (107-161)**

568 (458-706) **

34 (26-43)*

Почка

242 (185-295) **

212 (180-279) **

181 (162-249) **

165 (125-233)*

Данные представлены как медиана (межквартильный размах)

*p<0.01, **p<0.001 по сравнению с другими органами.

Заключение

Внеклеточный матрикс и лизосомальные протеазы играют существенную роль в межклеточных взаимодействиях. Использование катепсинов в исследованиях на клетках invitro, продуцирующих большое количество внеклеточного матрикса, представляется перспективным для моделирования некоторых звеньев патологических процессов. 

Ткани и органы лабораторных животных доступны для исследователей, в этом ключе использование в качестве источника лизосомальных протеаз органов крыс является оптимальным. Кроме того, биоматериал, полученный от лабораторных животных, является более качественным, что связано со стандартизацией содержания и быстрой пробоподготовкой, отсутствием у крыс профилактической антибиотикотерапии, которая, безусловно,  влияет на экспрессию протеаз. Поскольку масса печени превышает массу селезенки и почки в 14 и 10 раз соответственно (Табл. 1), то печень интактных крыс может служить источником выделения всех исследуемых катепсинов в случае использования для этого одного животного. В случае использования органов от группы животных из более чем 2-х особей ожидается, что  выход катепсина B может оказаться лучшим при использовании в качестве источника выделения селезенки крыс, а выход катепсина Lи S – при использовании в качестве источника выделения почек. 

Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых № МК-6370.2015.7.


Библиографическая ссылка

Воропаева А.А., Голубинская П.А., Садовой М.А., Русова Т.В. СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТЕПСИНОВ ВО ВНУТРЕННИХ ОРГАНАХ КРЫС, КАК ИСТОЧНИКАХ ЛИЗОСОМАЛЬНЫХ ПРОТЕАЗ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК ХРЯЩЕВОЙ И КОСТНОЙ ТКАНЕЙ // Современные проблемы науки и образования. – 2016. – № 5.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=25343 (дата обращения: 18.07.2019).


Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252