Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

РОЛЬ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ПАТОГЕНЕЗЕ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ

Гординская Н.А. 1 Алейник Д.Я. 1 Рубцова Ю.П. 1 Чарыкова И.Н. 1 Фролов А.П. 1
1 ФГБУ «ННИИТО» Минздрава России
В работе проанализирована экспрессия Toll-подобных рецепторов (TLR2 и TLR4) на CD14+ клетках периферической крови и оценена их функциональная активность у пациентов с тяжелой термической травмой в острый период ожоговой болезни. Выявлено повышение экспрессии TLR2 и снижение экспрессии TLR4 (p<0,05). Средняя интенсивность флюоресценции для TLR2 и TLR4 у тяжелообожженных достоверно ниже, чем у доноров. Наблюдалось снижение функциональной активности TLRs после ожога. У пострадавших с термической травмой продукция фактора некроза опухоли-α мононуклеарными клетками при использовании лиганда TLR2 (пептидогликана) и лиганда TLR4 (липополисахарида) была достоверно ниже, чем в группе доноров, что может служить причиной ослабления защитных функций при развитии ожоговой инфекции.
ожоговая болезнь
толл-подобные рецепторы
Врожденный противоинфекционный иммунитет
1. Байракова А.Л. Роль клеточных Toll-подобных рецепторов в формировании колонизационной резистентности урогенитального тракта при хламидиозе: Автореф. дис… канд. биол. наук. – М., 2009. – 17 с.
2. Двойственная роль толлподобных рецепторов в регуляции противоопухолевого иммунитета / И.О. Чикилева [и др.] //Иммунология. – 2010. – № 1. – С.52-55.
3. Катунина О.Р. Функции Толл-подобных рецепторов как компонента врожденного иммунитета и их участие в патогенезе дерматозов различной этиологии // Вестн. дерматол. и венерол. – 2011. – № 2. – С.18-25.
4. Хаитов Р.М., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Биология рецепторов врожденной иммунной системы // Физиол. и патол. иммун. сист. – 2008. – Т.12, № 6. – С.3-28.
5. Хорева М.В. Комплексный анализ системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека: Автореф. дис… д-ра мед. наук. – М., 2012. – 22 с.
6. Endogenous ligands of TLR2 and TLR4: agonists or assistants? / Erridge C. [еt al.] // J. Leukoc. Biol. – 2010. – Vol. 87, № 6. – P.989-999.
7. Expression of Toll-lice receptors in neonatal sepsis /D.Viemann [et.al.] // J. Pediatr. Res. – 2005. – Vol. 58. – P.654-659.
8. Iwasaki A., Mtdzhidov R. TLR-like receptor control of the adaptive immune responses // Nat. Immun. – 2004. –Vol. 5, № 10. – P.987-995.
9. Medzhidov R., Janeway Ch. Inname immune recognition // Curr. Opin. Immunol. – 1997. – № 9. – P. 4-9.
10. Medzhidov R., Janeway Ch. The TLR family and microbial recognition // Trends Microbiol. –2000. – Vol. 8, № 10. – P.452-457.
11. Monocyte TLR4 expression and LPS-induced cytocine production increase during gestational aging / E.K. Forster-Waldi [et al.] // J. Pediatr.Res. – 2005. – Vol. 58. – P.121-124.

Введение

Патогенез многих заболеваний в настоящее время претерпевает дополнительную расшифровку в связи с появлением новых научных данных о ряде молекулярных событий в иммунной системе человека. Одним из основных свойств иммунной системы является способность к обнаружению и распознаванию чужеродных веществ и развитию ответных реакций, направленных на выведение или связывание этих веществ.

При оценке состояния системы иммунитета в клинических и научных исследованиях несколько десятилетий изучались показатели адаптивного иммунитета. Адаптивный (лимфоцитарный) иммунитет является мощной защитой, обеспечивающей целенаправленный антигенспецифический иммунный ответ с формированием иммунологической памяти. Разработаны системные подходы к оценке показателей иммунитета, предложены многочисленные схемы иммунокоррекции при различных заболеваниях.

В настоящее время стало понятным, что адаптивный иммунный ответ является лишь эффекторным звеном врожденной иммунной системы. Система врожденного иммунитета, являясь филогенетически более древней линией защиты организма от патогенов, инициирует воспаление и фагоцитоз и обеспечивает быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще отсутствуют. В отличие от адаптивного иммунитета, функционирование которого обеспечивают Т- и В-лимфоциты, механизмы врожденной защиты не имеют какой-либо дифференцированной системы клеток, а представляют собой разнообразные рецепторы, молекулы и их комплексы, которые присутствуют на разных клетках и имеют одинаковое предназначение [9]. Задачей врожденных механизмов защиты является распознавание одинаковых структур, присутствующих у различных патогенов, подобные структуры называют патогенассоциированные молекулярные образы (pathogen-accociated molecular patterns-PAMPs), а рецепторы, распознающие данные «образы», называют патогенраспознающие (pathogen recognition receptops-PRRs) [9, 10]. Миграция клеток к очагу повреждения контролируется распознаванием PAMP сосудистым эндотелием. В целом распознавание PAMP эндотелиальными, эпителиальными, гемопоэтическими клетками с помощью специфических рецепторов является интегральным для врожденного противоинфекционного иммунитета. Наиболее изученными PAMPs являются липополисахариды бактериальной стенки, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, липотейхоевые кислоты, маннаны, зимозан грибов, ДНК и РНК бактерий и вирусов. Результаты научных исследований последних лет подтверждают, что в качестве PAMPs могут участвовать не только молекулярные структуры микроорганизмов, но и вещества немикробного происхождения. Было доказано, что к PAMPs относятся и различные эндогенные соединения макроорганизма, высвобождающиеся при массивном повреждении клеток, такие молекулы получили название «сигналы опасности» (damage associated molecular patterns-DAMPs). К DAMPs относят фибронектин, фибриноген, белки теплового шока Hsp70 и Hsp 60, которые вызывают выработку провоспалительных цитокинов при действии на TLR4 и TLR2 [6].

В зависимости от предназначения и функций патогенраспознающие рецепторы разделяют на три группы: секретируемые, эндоцитозные и сигнальные. Секретируемые PRRs выполняют функцию опсонинов, «помечая» микробные клетки и облегчая фагоцитоз. Эндоцитозные PRRs опосредуют разрушение патогена в лизосомах клеток макроорганизма и презентируют пептидные фрагменты макрофагам, сигнальные PRRs активизируют передачу сигнала в ядро клетки с целью экспрессии генов адаптивного (лимфоцитарного) иммунного ответа [9]. К настоящему времени известны несколько семейств сигнальных PRRs: Toll-подобные рецепторы (Toll-lice receptors-TLR), лектиновые рецепторы С-типа (C-tipe lectin receptors), рецепторы-мусорщики (scavenger receptors), NOD-подобные и RIG-подобные рецепторы [4].

Важность участия Toll-подобных рецепторов в деятельности иммунной системы было доказано в экспериментах на мышах с мутациями генов различных TLRs, где прослежена взаимосвязь с приобретенным иммунитетом через антигенпрезентирующие клетки [8]. Эти исследования послужили основой комплексного анализа системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека. В настоящее время роль рецепторов врожденного иммунитета широко обсуждается при изучении патологии новорожденных детей, в исследованиях патогенеза различных дерматозов, колонизационной резистентности урогенитального тракта, регуляции противоопухолевого иммунитета, развития острого инфаркта миокарда и других заболеваниях [1,2,3,5,7,11].

Цель исследования

Изучение экспрессии и функциональной активности TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови у пациентов с тяжелой термической травмой в острый период ожоговой болезни.

Материал и методы исследования

Группу здоровых доноров периферической крови составили 12 человек в возрасте от 20 до 45 лет. Группу обследованных пациентов составили 23 человека с тяжелой термической травмой на площади от 32 % до 60 % поверхности тела. Больные находились на стационарном лечении в ожоговом центре Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии, исследования проводились в острый период ожоговой болезни.

Выделение мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной крови (25 ЕД на 1 мл) с помощью градиентного центрифугирования при 1500 об/мин (градиент фиколл-урографин (ρ=1,077 г/см3) 40 минут и дважды отмывали средой RPMI 1640 при 1500 об/мин в течение 10 минут. После чего культивировали МНК в полной ростовой среде RPMI 1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (ООО «ПанЭко»), 2 % Мм глутамина и антибиотики (пенициллин 100 EД/мл и стрептомицин 50 мг/мл, ООО «ПанЭко»). Исходная концентрация МНК составляла 1×106 клеток/мл.

Стимуляция клеток. В качестве лигандов TLR использовали стимуляторы ЛПС (E.coli O127: B8; Sigma) в дозе 0,1 мкг/мл и пептидогликан (Staphylococcus aureus; «Sigma») в дозе 5 мкг/мл. Оптимальные дозы были выбраны на основании методических рекомендаций фирм производителей используемых лигандов и литературных данных. Клетки инкубировали в СО2 инкубаторе фирмы Sanyo (Япония) при 5 % СО2, 37 ⁰С и абсолютной влажности. Спонтанную выработку фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) определяли, культивируя МНК в полной ростовой среде без стимуляторов. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут. Отбирали супернатанты и хранили их в течение 1-2 месяцев при 80 ºС. Рассчитывали индекс стимуляции как отношение количества ФНО-α при использовании соответствующего лиганда к спонтанной выработке цитокина клетками.

Определение цитокинов. Продукцию ФНО-α определяли в супернатантах культур методом ИФА с помощью тест-систем фирмы Bioscience (США) на анализаторе Sunrise Tecan (Австрия), оснащенном системой Magellan, позволяющей в автоматическом режиме производить подсчет оптической плотности.

Определение экспрессии TLR. Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови МНК инкубировали с Fitc-меченными антителами к CD14 (Beckмan Coulter, США), PE-меченными антителами к TLR2 и APC-меченными антителами к TLR4 (Bioscience) с соответствующими изотипическими контролями (Beckмan Coulter) в течение 30 минут при 4 ºС. Анализ экспрессии СD14, TLR2 и TLR4 проводили на проточном цитофлюориметре (Beckмan Coulter). Оценивали процент моноцитов, несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4 и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флюоресценции.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение экспрессии TLR и их функциональной активности у тяжелообожженных больных является в определенной степени предварительным. Как показали результаты работы, экспрессия TLR2 на моноцитах периферической крови пациентов в первые пять суток после ожога достоверно выше, чем в группе доноров (p<0,05). Экспрессия TLR4 рецепторов, напротив, в острый период после травмы снижена (p<0,05, табл.1). Средняя интенсивность флюоресценции для TLR2 и TLR4 у тяжелообожженных больных значительно ниже, чем у здоровых доноров.

Таблица 1. Экспрессия TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови пациентов с тяжелой термической травмой и здоровых доноров

Группа обследованных

TLR2

СИФ

TLR4

СИФ

Доноры

55,6± 11%

100,0± 9,0

42± 4,6%

97,8± 12,4

Пациенты

97,3± 8,9%

13,4±5,1

27,04± 6,2%

3,08±0,9

Параллельно с изучением экспрессии Toll-подобных рецепторов анализировали выработку ФНО-α CD14+ клетками. Спонтанная выработка ФНО-α МНК периферической крови пациентов с тяжелой термической травмой была многократно выше, чем в группе доноров (табл. 2).

Таблица 2. Выработка ФНО-α МНК периферической крови здоровых доноров и пациентов с тяжелой термической травмой (пкг/мл)

Группа обследованных

Спонтанная выработка

Стимулированная ПГ

Стимулированная ЛПС

Доноры

25,4±6,8

59,7±3,2

687±18,8

Пациенты

1369±820

2152±976

3284±1080

Стимуляция МНК лигандами TLR приводила к увеличению продукции ФНО-α, однако в группе доноров индекс стимуляции составил 2,3 при использовании пептидогликана и 27,0 при использовании липополисахарида, а в группе пациентов - лишь 1,7 и 2,4 соответственно. Таким образом, острый период ожоговой болезни после тяжелой термической травмы характеризуется изменением экспрессии Толл-подобных рецепторов на мононуклеарных клетках периферической крови и усилением их функциональной активности, однако общий потенциал TLR2 и TLR4 у пациентов относительно показателей у доноров достоверно снижается. Низкий прирост уровня ФНО-α в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 может служить причиной ослабления защитных функций у тяжелообожженных при развитии ожоговой инфекции. Зависимости экспрессии TLR2 и TLR4 от этиологии раневой ожоговой инфекции в период наблюдений не было выявлено, направленность изменений сохранялась как у пациентов с грамотрицательной, так и у пациентов с грамположительной инфекцией. Динамический анализ изученных показателей в процессе лечения ожоговой болезни показал достаточную разнонаправленность как экспрессии Толл-подобных рецепторов, так и выработки ФНО-α МНК, вместе с тем наблюдалась прямая зависимость течения болезни и выраженности изученных показателей. У двух пациентов с летальным исходом болезни регистрировали резкое снижение функциональной активности TLR в отношении и спонтанной продукции ФНО-α, и стимулированной лигандами TLR практически до нуля, при этом экспрессия рецепторов соответствовала таковой у выживших пациентов.

Выводы

Таким образом, анализ выработки цитокинов стимулированными лигандами TLR мононуклеарных клеток периферической крови и определение поверхностной экспрессии CD14+ Толл-подобных рецепторов дают важную информацию при оценке функционального состояния врожденного иммунитета и должны рассматриваться в качестве маркеров течения ожоговой болезни. Лекарственные воздействия через Толл-подобные рецепторы, по всей вероятности, могут дать возможность управления выраженностью системной воспалительной реакции в разные периоды ожоговой болезни.

Рецензенты:

Никифоров В.А., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией микробиологии ФБУН ННИИЭМ им. Академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, г. Нижний Новгород.

Заславская М.И., д.б.н., профессор кафедры микробиологии и иммунологии, ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России, г. Нижний Новгород.


Библиографическая ссылка

Гординская Н.А., Алейник Д.Я., Рубцова Ю.П., Чарыкова И.Н., Фролов А.П. РОЛЬ РЕЦЕПТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ПАТОГЕНЕЗЕ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНИ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=10968 (дата обращения: 18.04.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252