Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

ROLE OF INNATE IMMUNITY RECEPTORS IN THE PATHOGENESIS OF BURN DISEASE

Gordinskaya N.A. 1 Aleynik D.Ya. 1 Rubtsova Yu.P. 1 Charykova I.N. 1 Frolov A.P. 1
1 Nizhny Novgorod Research Institute of Traumatology and Orthopedics
В работе проанализирована экспрессия Toll-подобных рецепторов (TLR2 и TLR4) на CD14+ клетках периферической крови и оценена их функциональная активность у пациентов с тяжелой термической травмой в острый период ожоговой болезни. Выявлено повышение экспрессии TLR2 и снижение экспрессии TLR4 (p<0,05). Средняя интенсивность флюоресценции для TLR2 и TLR4 у тяжелообожженных достоверно ниже, чем у доноров. Наблюдалось снижение функциональной активности TLRs после ожога. У пострадавших с термической травмой продукция фактора некроза опухоли-α мононуклеарными клетками при использовании лиганда TLR2 (пептидогликана) и лиганда TLR4 (липополисахарида) была достоверно ниже, чем в группе доноров, что может служить причиной ослабления защитных функций при развитии ожоговой инфекции.
This research analyzes expression of Toll-like receptors (TLR2 and TLR4) on CD14+ peripheral blood cells and evaluates their functional activity in patients with severe thermal injuries in the acute period of burn disease. TLR2 expression increase and TLR4 expression decrease (p<0,05) was detected. Medium intensity of fluorescence for TLR2 and TLR4 in patients with severe burns was truly lower than in donors. Decrease in functional activity of TLRs after burn was observed. Production of TNF alpha by mononuclear cells with the use of TLR2 ligand (peptidoglycane) and TLR4 ligand (lipopolyssacharide) was truly lower in patients with thermal injuries than in donor group, which may be the cause for weakening of protective functions in burn infection development.
burn disease
toll-like receptors
Innate anti-infectious immunity

Введение

Патогенез многих заболеваний в настоящее время претерпевает дополнительную расшифровку в связи с появлением новых научных данных о ряде молекулярных событий в иммунной системе человека. Одним из основных свойств иммунной системы является способность к обнаружению и распознаванию чужеродных веществ и развитию ответных реакций, направленных на выведение или связывание этих веществ.

При оценке состояния системы иммунитета в клинических и научных исследованиях несколько десятилетий изучались показатели адаптивного иммунитета. Адаптивный (лимфоцитарный) иммунитет является мощной защитой, обеспечивающей целенаправленный антигенспецифический иммунный ответ с формированием иммунологической памяти. Разработаны системные подходы к оценке показателей иммунитета, предложены многочисленные схемы иммунокоррекции при различных заболеваниях.

В настоящее время стало понятным, что адаптивный иммунный ответ является лишь эффекторным звеном врожденной иммунной системы. Система врожденного иммунитета, являясь филогенетически более древней линией защиты организма от патогенов, инициирует воспаление и фагоцитоз и обеспечивает быструю элиминацию патогенов и предотвращение инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще отсутствуют. В отличие от адаптивного иммунитета, функционирование которого обеспечивают Т- и В-лимфоциты, механизмы врожденной защиты не имеют какой-либо дифференцированной системы клеток, а представляют собой разнообразные рецепторы, молекулы и их комплексы, которые присутствуют на разных клетках и имеют одинаковое предназначение [9]. Задачей врожденных механизмов защиты является распознавание одинаковых структур, присутствующих у различных патогенов, подобные структуры называют патогенассоциированные молекулярные образы (pathogen-accociated molecular patterns-PAMPs), а рецепторы, распознающие данные «образы», называют патогенраспознающие (pathogen recognition receptops-PRRs) [9, 10]. Миграция клеток к очагу повреждения контролируется распознаванием PAMP сосудистым эндотелием. В целом распознавание PAMP эндотелиальными, эпителиальными, гемопоэтическими клетками с помощью специфических рецепторов является интегральным для врожденного противоинфекционного иммунитета. Наиболее изученными PAMPs являются липополисахариды бактериальной стенки, липопротеины, гликолипиды, флагеллин, липотейхоевые кислоты, маннаны, зимозан грибов, ДНК и РНК бактерий и вирусов. Результаты научных исследований последних лет подтверждают, что в качестве PAMPs могут участвовать не только молекулярные структуры микроорганизмов, но и вещества немикробного происхождения. Было доказано, что к PAMPs относятся и различные эндогенные соединения макроорганизма, высвобождающиеся при массивном повреждении клеток, такие молекулы получили название «сигналы опасности» (damage associated molecular patterns-DAMPs). К DAMPs относят фибронектин, фибриноген, белки теплового шока Hsp70 и Hsp 60, которые вызывают выработку провоспалительных цитокинов при действии на TLR4 и TLR2 [6].

В зависимости от предназначения и функций патогенраспознающие рецепторы разделяют на три группы: секретируемые, эндоцитозные и сигнальные. Секретируемые PRRs выполняют функцию опсонинов, «помечая» микробные клетки и облегчая фагоцитоз. Эндоцитозные PRRs опосредуют разрушение патогена в лизосомах клеток макроорганизма и презентируют пептидные фрагменты макрофагам, сигнальные PRRs активизируют передачу сигнала в ядро клетки с целью экспрессии генов адаптивного (лимфоцитарного) иммунного ответа [9]. К настоящему времени известны несколько семейств сигнальных PRRs: Toll-подобные рецепторы (Toll-lice receptors-TLR), лектиновые рецепторы С-типа (C-tipe lectin receptors), рецепторы-мусорщики (scavenger receptors), NOD-подобные и RIG-подобные рецепторы [4].

Важность участия Toll-подобных рецепторов в деятельности иммунной системы было доказано в экспериментах на мышах с мутациями генов различных TLRs, где прослежена взаимосвязь с приобретенным иммунитетом через антигенпрезентирующие клетки [8]. Эти исследования послужили основой комплексного анализа системы Toll-подобных рецепторов при различных патологических состояниях человека. В настоящее время роль рецепторов врожденного иммунитета широко обсуждается при изучении патологии новорожденных детей, в исследованиях патогенеза различных дерматозов, колонизационной резистентности урогенитального тракта, регуляции противоопухолевого иммунитета, развития острого инфаркта миокарда и других заболеваниях [1,2,3,5,7,11].

Цель исследования

Изучение экспрессии и функциональной активности TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови у пациентов с тяжелой термической травмой в острый период ожоговой болезни.

Материал и методы исследования

Группу здоровых доноров периферической крови составили 12 человек в возрасте от 20 до 45 лет. Группу обследованных пациентов составили 23 человека с тяжелой термической травмой на площади от 32 % до 60 % поверхности тела. Больные находились на стационарном лечении в ожоговом центре Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии, исследования проводились в острый период ожоговой болезни.

Выделение мононуклеарных клеток. Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из гепаринизированной крови (25 ЕД на 1 мл) с помощью градиентного центрифугирования при 1500 об/мин (градиент фиколл-урографин (ρ=1,077 г/см3) 40 минут и дважды отмывали средой RPMI 1640 при 1500 об/мин в течение 10 минут. После чего культивировали МНК в полной ростовой среде RPMI 1640, содержащей 10 % телячьей эмбриональной сыворотки (ООО «ПанЭко»), 2 % Мм глутамина и антибиотики (пенициллин 100 EД/мл и стрептомицин 50 мг/мл, ООО «ПанЭко»). Исходная концентрация МНК составляла 1×106 клеток/мл.

Стимуляция клеток. В качестве лигандов TLR использовали стимуляторы ЛПС (E.coli O127: B8; Sigma) в дозе 0,1 мкг/мл и пептидогликан (Staphylococcus aureus; «Sigma») в дозе 5 мкг/мл. Оптимальные дозы были выбраны на основании методических рекомендаций фирм производителей используемых лигандов и литературных данных. Клетки инкубировали в СО2 инкубаторе фирмы Sanyo (Япония) при 5 % СО2, 37 ⁰С и абсолютной влажности. Спонтанную выработку фактора некроза опухоли-α (ФНО-α) определяли, культивируя МНК в полной ростовой среде без стимуляторов. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 15 минут. Отбирали супернатанты и хранили их в течение 1-2 месяцев при 80 ºС. Рассчитывали индекс стимуляции как отношение количества ФНО-α при использовании соответствующего лиганда к спонтанной выработке цитокина клетками.

Определение цитокинов. Продукцию ФНО-α определяли в супернатантах культур методом ИФА с помощью тест-систем фирмы Bioscience (США) на анализаторе Sunrise Tecan (Австрия), оснащенном системой Magellan, позволяющей в автоматическом режиме производить подсчет оптической плотности.

Определение экспрессии TLR. Для определения экспрессии TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови МНК инкубировали с Fitc-меченными антителами к CD14 (Beckмan Coulter, США), PE-меченными антителами к TLR2 и APC-меченными антителами к TLR4 (Bioscience) с соответствующими изотипическими контролями (Beckмan Coulter) в течение 30 минут при 4 ºС. Анализ экспрессии СD14, TLR2 и TLR4 проводили на проточном цитофлюориметре (Beckмan Coulter). Оценивали процент моноцитов, несущих на своей поверхности TLR2 и TLR4 и среднюю интенсивность флюоресценции (СИФ), величину которой выражали в условных единицах (усл. ед.) флюоресценции.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение экспрессии TLR и их функциональной активности у тяжелообожженных больных является в определенной степени предварительным. Как показали результаты работы, экспрессия TLR2 на моноцитах периферической крови пациентов в первые пять суток после ожога достоверно выше, чем в группе доноров (p<0,05). Экспрессия TLR4 рецепторов, напротив, в острый период после травмы снижена (p<0,05, табл.1). Средняя интенсивность флюоресценции для TLR2 и TLR4 у тяжелообожженных больных значительно ниже, чем у здоровых доноров.

Таблица 1. Экспрессия TLR2 и TLR4 на моноцитах периферической крови пациентов с тяжелой термической травмой и здоровых доноров

Группа обследованных

TLR2

СИФ

TLR4

СИФ

Доноры

55,6± 11%

100,0± 9,0

42± 4,6%

97,8± 12,4

Пациенты

97,3± 8,9%

13,4±5,1

27,04± 6,2%

3,08±0,9

Параллельно с изучением экспрессии Toll-подобных рецепторов анализировали выработку ФНО-α CD14+ клетками. Спонтанная выработка ФНО-α МНК периферической крови пациентов с тяжелой термической травмой была многократно выше, чем в группе доноров (табл. 2).

Таблица 2. Выработка ФНО-α МНК периферической крови здоровых доноров и пациентов с тяжелой термической травмой (пкг/мл)

Группа обследованных

Спонтанная выработка

Стимулированная ПГ

Стимулированная ЛПС

Доноры

25,4±6,8

59,7±3,2

687±18,8

Пациенты

1369±820

2152±976

3284±1080

Стимуляция МНК лигандами TLR приводила к увеличению продукции ФНО-α, однако в группе доноров индекс стимуляции составил 2,3 при использовании пептидогликана и 27,0 при использовании липополисахарида, а в группе пациентов - лишь 1,7 и 2,4 соответственно. Таким образом, острый период ожоговой болезни после тяжелой термической травмы характеризуется изменением экспрессии Толл-подобных рецепторов на мононуклеарных клетках периферической крови и усилением их функциональной активности, однако общий потенциал TLR2 и TLR4 у пациентов относительно показателей у доноров достоверно снижается. Низкий прирост уровня ФНО-α в ответ на лиганды TLR2 и TLR4 может служить причиной ослабления защитных функций у тяжелообожженных при развитии ожоговой инфекции. Зависимости экспрессии TLR2 и TLR4 от этиологии раневой ожоговой инфекции в период наблюдений не было выявлено, направленность изменений сохранялась как у пациентов с грамотрицательной, так и у пациентов с грамположительной инфекцией. Динамический анализ изученных показателей в процессе лечения ожоговой болезни показал достаточную разнонаправленность как экспрессии Толл-подобных рецепторов, так и выработки ФНО-α МНК, вместе с тем наблюдалась прямая зависимость течения болезни и выраженности изученных показателей. У двух пациентов с летальным исходом болезни регистрировали резкое снижение функциональной активности TLR в отношении и спонтанной продукции ФНО-α, и стимулированной лигандами TLR практически до нуля, при этом экспрессия рецепторов соответствовала таковой у выживших пациентов.

Выводы

Таким образом, анализ выработки цитокинов стимулированными лигандами TLR мононуклеарных клеток периферической крови и определение поверхностной экспрессии CD14+ Толл-подобных рецепторов дают важную информацию при оценке функционального состояния врожденного иммунитета и должны рассматриваться в качестве маркеров течения ожоговой болезни. Лекарственные воздействия через Толл-подобные рецепторы, по всей вероятности, могут дать возможность управления выраженностью системной воспалительной реакции в разные периоды ожоговой болезни.

Рецензенты:

Никифоров В.А., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией микробиологии ФБУН ННИИЭМ им. Академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, г. Нижний Новгород.

Заславская М.И., д.б.н., профессор кафедры микробиологии и иммунологии, ГБОУ ВПО НижГМА Минздрава России, г. Нижний Новгород.