Введение
На сегодняшний день известно более 500 нозологических формнаследственных болезней обмена (НБО). Основная часть НБО встречается крайне редко, но их суммарная частота в популяции составляет 1:1000-1:5000 [1-2]. Как правило, НБО манифестируютна первом году жизни неспецифическими симптомами, клинически маскирующими их под другую, ненаследственную соматическую патологию. Вместе с тем, своевременная диагностика метаболических наследственных заболеваний важна, так как для многих из них разработаны и продолжают разрабатываться эффективные методы патогенетического лечения, без которого исход заболеваний зачастую остается фатальным. Общепризнано, что одним из наиболее оправданных и эффективных подходов к раннему выявлению наследственной патологии является неонатальный генетический скрининг. Развитие метода тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с электроспрейной ионизацией [3] сделало крупномасштабный масс-спектрометрический скрининг применимым в практике массового обследования на НБО к концу 90-х годов ХХ века. Этот высокочувствительный микрометод позволяет одновременно определять в нескольких микролитрах крови концентрации десятков аминокислот и ацилкарнитинов, имеющих значение для диагностики НБО. Эффективность лабораторного теста МС/МС позволила включить его в государственные программы неонатального скрининга новорожденных детей на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального β-окисления жирных кислот в ряде стран [5, 6]. Тем не менее, в Российской Федерации метод МС/МС не внедрен в систему массового обследования новорожденных детей и доступен для селективного скрининга на НБО только в единичных федеральных медицинских центрах.
Целью данного исследования явилось научное обоснование необходимости включения в региональные программы массового обследования новорожденных детей исследований методом МС/МС для диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления жирных кислот на основе проведения ретроспективного масс-спектрометрического анализа образцов крови больных детей, заболевания которых закончились летальным исходом на первом году жизни.
Пациенты и методы исследования
В настоящее ретроспективное исследование включены дети (n=86, соотношение мальчики:девочки 48/38), умершие на первом году жизни (в возрасте от 5 суток до 11 месяцев жизни) в течение одного календарного года (2010 год) на административной территории Краснодарского края. В исследование включены дети с врожденными пороками развития (n=29), инфекционными заболеваниями - пневмония, сепсис, бактериальный менингоэнцефалит (n=37), перинатальным поражением ЦНС (n=11), синдромом внезапной смерти (n=6) и иными заболеваниями (n=3). Контрольную группу составили 438 клинически здоровых новорожденных детей (227 девочек, 211 мальчиков) в возрасте 3-8 дней. В данной группе были определены референсные значения концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в капиллярной крови у здоровых детей периода новорожденности.
Материалом для исследования послужили архивные образцы периферической крови на стандартных бумажных тест-бланках, полученные на 3-8 день жизни, для проведения стандартного неонатального скрининга. Концентрацию аминокислот и ацилкарнитинов (табл. 1) в крови определяли методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с помощью квадрупольного тандемного масс-спектрометра Agilent 6410 (AgilentTechnologies, США) по сертифицированной методике компании CHROMSYSTEM № V1 07 05 57136 001. Исследование было выполнено в лаборатории медицинской генетики ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский институт Минздрава России».
Таблица 1
Метаболиты, определяемые методом МС/МС
№ |
Метаболит |
Условное обозначение |
№ |
Метаболит |
Услов-ное обозна-чение |
А м и н о к и с л о т ы |
|
||||
1. |
Аланин |
Ala |
21. |
3-метилкротонилкарнтин |
C5:1 |
2. |
Аспарагиноваякислота |
Asp |
22. |
3-гидроксиизовалерилкарнитин |
C5OH |
3. |
Глутаминоваякислота |
Glu |
23. |
Гексаноилкарнитин |
C6 |
4. |
Лейцин+изолейцин |
Xle |
24. |
Октаноилкарнитин |
C8 |
5. |
Метионин |
Met |
25. |
Октеноилкарнитин |
C8:1 |
6. |
Фенилаланин |
Phe |
26. |
Деканоилкарнитин |
C10 |
7. |
Тирозин |
Tyr |
27. |
Деценоилкарнитин |
C10:1 |
8. |
Валин |
Val |
28. |
Додеканоилкарнитин |
C12 |
9. |
Аргинин |
Arg |
29. |
Миристилкарнитин |
C14 |
10. |
Цитруллин |
Cit |
30. |
Тетрадеценоилкарнитин |
C14:1 |
11. |
Глицин |
Gly |
31. |
Тетрадециноилкарнитин |
C14:2 |
12. |
Орнитин |
Orn |
32. |
Гидроксимиристилкарнтин |
C14OH |
А ц и л к а р н и т и н ы |
33. |
Пальмитоилкарнитин |
С16 |
||
13. |
Свободныйкарнитин |
C0 |
34. |
Гексадеценоилкарнитин |
C16:1 |
14. |
Ацетилкарнитин |
C2 |
35. |
Гидроксигексадеценоилкарнитин |
C16:1OH |
15. |
Пропионилкарнитин |
C3 |
36. |
Гидроксипальмитоилкарнитин |
C16OH |
16. |
Малонилкарнитин |
C3DC |
37. |
Стеароилкарнитин |
C18 |
17. |
Бутирилкарнтин |
C4 |
38. |
Олеоилкарнитин |
C18:1 |
18. |
Метилмалонилкарнитин |
C4DС |
39. |
Гидроксистеароилкарнитин |
C18OH |
19. |
Изовалерилкарнтин |
C5 |
40. |
Гидроксиолеоилкарнитин |
C18:1OH |
20. |
Глутарилкарнитин |
C5DC |
41. |
Гидроксилиноилкарнитин |
C18:2OH |
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 и электронных таблиц Excel 2007. Для определения описательных числовых характеристик переменных применялись стандартные методики статистического анализа: расчет медианы, 0,5 и 99,5 перцентилей.
Для подтверждающей молекулярно-генетической диагностики лейциноза проводили выделение ДНК из сухих пятен крови, используя набор реактивов DiatomDNAPrep (ООО «Биоком», Россия). Подбор праймеровдля ПЦР амплификации осуществляли для 10 экзонов генов BCKDHA и BCKDHB. Секвенирование ПЦР-фрагментов с целью выявления редких мутаций проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на генетическом анализаторе ABIPrism 3500 (AppliedBiosystem, США).
Результаты исследования и их обсуждение
В результате исследования концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови 438 клинически здоровых новорожденных детей были определены 0,5 и 99,5 перцентиликонцентраций исследованных метаболитов, которые использовались нами в дальнейшем как референсные значения (табл. 2). Сопоставление концентраций аминокислот и ацилкарнитинов, определенных в образцах крови 86 умерших на первом году жизни детей, с референсными значениями концентраций, показало, что у 82 пациентов (95,3 %) ни один из исследуемых показателей не выходил за пределы 0,5 и 99,5 перцентилей контрольной группы, что позволило отказаться от рабочей версии о наличии у них нарушений обмена аминокислот и карнитинов, не верифицированных прижизненно. Однако у 4 детей (4,7 %) концентрации некоторых аминокислот и ацилкарнитиновв несколько раз превышали верхние границы референсного интервала контрольной группы (табл. 2).
Таблица 2
Результаты ретроспективной оценки концентраций аминокислот и ацилкарнитинов у новорожденных (n=4) с уровнем отдельных метаболитов вне диапазона 0,5-99,5 перцентилей
№ |
Метаболиты |
Концентрации отдельных метаболитов (мкмоль/л) |
||||
Референсные значения контрольной группы (n= 438) в диапазоне 0,5-99,5 перцентилей |
Индивидуальные значения пациентов (n=4) *
|
|||||
Пациент 1 |
Пациент 2 |
Пациент 3 |
Пациент 4 |
|||
А м и н о к и с л о т ы |
||||||
1. |
Ala |
63,68 - 667,82 |
77,191 |
696,2 |
376,3 |
1454,7 |
2. |
Asp |
25,76 - 226,2 |
146,482 |
38,309 |
192,888 |
116,147 |
3. |
Glu |
262,2 - 1310,89 |
138,718 |
239,486 |
944,055 |
875,559 |
4. |
Xle |
55,4 - 266,92 |
2503,868 |
568,038 |
374,191 |
476,129 |
5. |
Met |
7,02 - 28,99 |
2,192 |
39,939 |
11,595 |
49,706 |
6. |
Phe |
23,09 - 94,94 |
40,907 |
138,571 |
77,324 |
239,842 |
7. |
Tyr |
20,08 - 171,45 |
16,783 |
25,600 |
41,963 |
204,371 |
8. |
Val |
41,53 - 196,87 |
654,143 |
351,693 |
138,619 |
283,070 |
9. |
Arg |
4,93 - 37,75 |
23,095 |
88,849 |
24,646 |
38,014 |
10. |
Cit |
4,75 - 33,57 |
17,517 |
10,448 |
34,673 |
30,834 |
11. |
Gly |
179,3 - 979,0 |
285,120 |
312,969 |
523,159 |
1457,474 |
12. |
Orn |
39,2 - 354,51 |
31,392 |
43,233 |
265,230 |
139,048 |
А ц и л к а р н и т и н ы |
||||||
13. |
C0 |
7,54-69,9 |
39,077 |
30,547 |
31,548 |
109,293 |
14. |
C2 |
6,14-63,92 |
2,448 |
4,402 |
5,315 |
35,754 |
15. |
C3 |
0,4-4,43 |
1,114 |
0,888 |
0,351 |
1,494 |
16. |
C3DC |
0,023-0,16 |
0,037 |
0,013 |
0,094 |
0,073 |
17. |
C4 |
0,06-0,7 |
0,109 |
0,187 |
0,618 |
1,319 |
18. |
C4DC |
0,091-0,56 |
0,109 |
0,055 |
0,177 |
0,171 |
19. |
C5 |
0,05-0,39 |
0,057 |
0,213 |
0,483 |
0,564 |
20. |
C5DC |
0,003-0,24 |
0,023 |
0,063 |
0,298 |
0,334 |
21. |
C5:1 |
0-0,03 |
0,014 |
0,010 |
0,119 |
0,027 |
22. |
C5OH |
0,047-0,27 |
0,088 |
0,066 |
0,380 |
0,168 |
23. |
C6 |
0,008-0,1 |
0,063 |
0,030 |
0,142 |
0,170 |
24. |
C8 |
0,016-0,14 |
0,038 |
0,024 |
0,192 |
0,240 |
25. |
C8:1 |
0,019-0,12 |
0,031 |
0,036 |
0,049 |
0,173 |
26. |
C10 |
0,024-0,21 |
0,060 |
0,040 |
0,177 |
0,117 |
27. |
C10:1 |
0,01-0,07 |
0,014 |
0,021 |
0,152 |
0,149 |
28. |
C12 |
0,098-1,06 |
0,139 |
0,178 |
0,293 |
0,176 |
29. |
C14 |
0,05-0,421 |
0,085 |
0,141 |
0,191 |
0,129 |
30. |
C14:1 |
0,04-0,34 |
0,084 |
0,083 |
0,135 |
0,072 |
31. |
C14:2 |
0,007-0,04 |
0,026 |
0,010 |
0,028 |
0,030 |
32. |
C14OH |
0,003-0,05 |
0,008 |
0,006 |
0,115 |
0,021 |
33. |
C16 |
0,72-6,41 |
0,404 |
1,995 |
1,622 |
1,499 |
34. |
C16:1 |
0,031-0,35 |
0,043 |
0,158 |
0,209 |
0,141 |
35. |
C16:1OH |
0,011-0,07 |
0,020 |
0,017 |
0,089 |
0,032 |
36. |
C16OH |
0,01-0,05 |
0,022 |
0,011 |
0,190 |
0,020 |
37. |
C18 |
0,24-1,51 |
0,154 |
0,287 |
0,483 |
0,521 |
38. |
C18:1 |
0,29-2,34 |
0,423 |
0,591 |
0,776 |
0,833 |
39. |
C18OH |
0,005-0,02 |
0,006 |
0,003 |
0,036 |
0,003 |
40. |
C18:1OH |
0,006-0,03 |
0,008 |
0,005 |
0,063 |
0,014 |
41. |
C18:2OH |
0-0,01 |
0,003 |
0,002 |
0,006 |
0,002 |
* Примечание:
Пациент 1 - мальчик КМ (диагноз: обструктивный бронхиолит), умер в возрасте 11 месяцев;
Пациент 2 - мальчик КФ (диагноз: пневмония), умер в возрасте 1 месяца;
Пациент 3 - девочка ЛВ (диагноз: сепсис), умер в возрасте 12 суток.
Пациент 4 - девочка ПА (диагноз: пневмония), умерла в возрасте 6 суток.
В первом случае у пациента КМ, умершего в возрасте 11 месяцев, с диагнозом обструктивный бронхиолит, тандемная масс-спектрометрия аминокислот и ацилкарнитинов в архивных образцах крови выявила изменения содержания лейцина, изолейцина и валина, которые носят достаточно специфический характер, чтобы говорить о высокой вероятности врожденного метаболического дефекта в пути катаболизма лейцина и изолейцина. В исследованных архивных образцах крови обнаружено увеличение концентрации лейцина и изолейцина более чем в 9 раз и валина - более чем в 3 раза по сравнению с референсными значениями, что позволяет предположить диагноз «болезни с запахом мочи кленового сиропа» [1, 2, 4].
Из имеющихся клинических данных в пользу лейциноза у ребенка КМ свидетельствовали следующие клинические проявления: ранний отказ от естественного вскармливания, симптомы неонатальной энцефалопатии, нарастание неврологической симптоматики - изменения мышечного тонуса, судороги, эпилепсия, задержка психомоторного развития. У ребенка часто наблюдались инфекционные заболевания дыхательных путей с тяжелым течением, которые стали причиной облитерирующего бронхиолита, явившегося причиной летального исхода в возрасте 11 месяцев. Мы не обладаем информацией о том, был ли у ребенка специфический запах мочи, но увеличение концентрации типичных для лейциноза метаболитов и характерная клиническая симптоматика подтверждают наше предположение. Кроме того, в пользу диагноза болезни запаха мочи кленового сиропа свидетельствуют результаты проведенной ДНК диагностики лейциноза с использованием архивных образцов крови. Молекулярно-генетический анализ позволил выявить у ребенка делецию с.98delG в первом экзоне гена BCKDHB в гетерозиготном состоянии. Эта же мутация обнаружена в крови матери. Ввиду ограниченного количества архивных образцов крови ребенка и недоступности биологического материала его отца вторую мутацию обнаружить не удалось. Тем не менее, совокупность клинических, биохимических и молекулярно-генетических данных подтверждают диагноз лейциноза (или болезни с запахом мочи кленового сиропа, MIM ID 248600) в изученном случае.
В остальных трех случаях выявленные изменения профиля аминокислот и ацилкарнитинов не носят такого же специфического характера, как в предыдущем случае. Предполагать определенные НБО, основываясь на данных МС/МС,тем более - утверждать с достоверностью, в этих случаях невозможно. Для дифференциальной диагностики аминоацидопатий и органических ацидурий необходимы были бы повторные исследования крови методом МС/МС, дополнительные клинические и биохимические исследования.
Степень повышения специфичных для заболеваний метаболитов вариабельна и зависит от многих факторов. Характер питания ребенка, прием некоторых лекарственных препаратов должны учитываться при интерпретации результатов. Так, прием препаратов, содержащих вальпроевую кислоту или среднецепочечные триглицериды, приводит к повышению С6, С8 и С10, что затрудняет диагностику недостаточности среднецепочечной ацил-КоАдегидрогеназы. Прием карнитинсодержащих лекарственных препаратов также может приводить к повышению концентраций коротко- и среднецепочечных ацилкарнитинов. Содержание длинноцепочечных ацилкарнитинов в плазме и цельной крови различно, поскольку они ассоциированы с мембранами эритроцитов, следовательно, показатель гематокрита имеет определенное значение. За некоторым исключением, полутора - двукратное увеличение концентрации требует повторного анализа крови. Так, патогномоничные для пропионовой и изовалериановой ацидурии уровни метаболитов обычно повышаются более чем в 5 раз, а даже незначительное изменение концентрации глутарилкарнитина требует не только повторного анализа крови, но и дополнительного исследования органических кислот мочи, характерных для глутаровой ацидурии I типа [6, 7].
Заключение
Проведенное методом МС/МС ретроспективное исследование образцов крови детей раннего возраста, умерших от различных причин, позволило предположить в ряде случаев наследственную патологию обмена веществ. В одном из них подтвержден диагноз болезни запах мочи кленового сиропа (лейциноз). Своевременные диагностические мероприятия в подобных случаях являются важной составляющей в дифференциальной диагностике врожденных ошибок метаболизма. Исследование концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в образцах биологических жидкостей может иметь диагностическую ценность в анализе случаев младенческой смертности. Посмертно установленный диагноз наследственного заболевания обмена веществ у умершего ребенка является показанием для медико-генетического консультирования семьи. Необходимо широкое внедрение метода МС/МС в неонатальный скрининг как основного инструмента для выявления аминоацидопатий, органических ацидемий и дефектов β-митохондриального окисления жирных кислот у новорожденных для своевременной диагностики и лечения НБО.
Рецензенты:
Полевиченко Елена Владимировна, д-р мед. наук, профессор, главный научный сотрудник отдела реабилитации и медико-социальной помощи ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России, г. Москва.
Михайлова Светлана Витальевна, д-р мед. наук, заведующая отделением медицинской генетики ФГБУ «Российская детская клиническая больница Минздрава России», г. Москва.