Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Байдакова Г.В. 1 Антонец А.В. 2 Голихина Т.А. 3 Матулевич С.А. 3 Амелина С.С. 2 Куцев С.И. 4, 1
1 ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН
2 ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России”
3 ГБУЗ "Краевая клиническая больница № 1 им. профессора С.В.Очаповского" департамента здравоохранения Краснодарского края
4 ФГБУ “Медико-генетический научный центр”
С целью обоснования внедрения массового обследования новорождённых на наследственные болезни обмена (НБО) методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) проведено ретроспективное исследование архивных образцов крови детей (n=86), умерших на первом году жизни. Изменения профилей аминокислот и ацилкарнитинов выявлены в 4 случаях (4,7 %). В одном из них обнаружено специфичное для болезни запаха мочи кленового сиропа многократное повышение концентрации лейцина, изолейцина и валина. Клиническая картина и обнаружение мутации в первом экзоне гена BCKDHB (с.98delG) в гетерозиготном состоянии косвенно подтвердили диагноз лейциноза. В остальных трех случаях выявленные изменения профиля аминокислот и ацилкарнитинов не носят такого же специфического характера. В этих случаях необходимы были бы повторные исследования крови методом МС/МС, дополнительные клинические и биохимические исследования. В результате проведенного исследования подтверждена необходимость внедрения метода МС/МС в программы неонатального скрининга на НБО для их своевременной диагностики и лечения.
ретроспективная диагностика
тандемная масс-спектрометрия
наследственные болезни обмена
1. Краснопольская К. Д. Наследственные болезни обмена веществ. Справочное пособие для врачей. - М.: РОО «Центр социальной адаптации и реабилитации детей «Фохат», 2005. - 364 с.
2. Михайлова С. В., Захарова Е. Ю., Петрухин А. С. Нейрометаболические заболевания у детей и подростков. Диагностика и подходы к лечению. - М.: «Литерра», 2011. - 352 с.
3. Chace H. D. Rapid diagnosis of MCAD deficiency quantitative analysis of octanoylcarnitine and other acylcarnitines in newborn blood spots by tandem mass spectrometry / Chace H. D., Hillman S. L., Van Hove J. L. et al. // Clinical Chemistry. - 1997. - V. 43. - № 11. - Р. 2106-2113.
4. Nyhan L. W., Barshop B. A., Ozand P. T. Atlas of metabolic diseases. - Second edition. - London: Hodder Arnold, 2005. - 788 p.
5. Rashed M. S. Clinical application of tandem mass spectrometry: ten years of diagnosis and screening for inherited metabolic diseases // J. of Chrom. B. - 2001. - V. 758. - № 27-48.
6. Sweetman L. Naming and counting disorders (counditions) included in newborn screening panels / Sweetman L., Millington D. S., Therrell B. L. et al. // Pediatrics. - 2006. - V. 117. - P. 308-314.
7. Van Hove J. L. Medium-chain acl-CoA dehydrogenase deficiency: diagnosis by acylcarnititne analysis in blood/Van Hove J. L., Zhang W., Kahler S. G. et al. // Am. J. Hum. Genet. - 1993. - V. 52. - P. 958-966.

Введение

На сегодняшний день известно более 500 нозологических формнаследственных болезней обмена (НБО). Основная часть НБО встречается крайне редко, но их суммарная частота в популяции составляет 1:1000-1:5000 [1-2]. Как правило, НБО манифестируютна первом году жизни неспецифическими симптомами, клинически маскирующими их под другую, ненаследственную соматическую патологию. Вместе с тем, своевременная диагностика метаболических наследственных заболеваний важна, так как для многих из них разработаны и продолжают разрабатываться эффективные методы патогенетического лечения, без которого исход заболеваний зачастую остается фатальным. Общепризнано, что одним из наиболее оправданных и эффективных подходов к раннему выявлению наследственной патологии является неонатальный генетический скрининг. Развитие метода тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с электроспрейной ионизацией [3] сделало крупномасштабный масс-спектрометрический скрининг применимым в практике массового обследования на НБО к концу 90-х годов ХХ века. Этот высокочувствительный микрометод позволяет одновременно определять в нескольких микролитрах крови концентрации десятков аминокислот и ацилкарнитинов, имеющих значение для диагностики НБО. Эффективность лабораторного теста МС/МС позволила включить его в государственные программы неонатального скрининга новорожденных детей на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального β-окисления жирных кислот в ряде стран [5, 6]. Тем не менее, в Российской Федерации метод МС/МС не внедрен в систему массового обследования новорожденных детей и доступен для селективного скрининга на НБО только в единичных федеральных медицинских центрах.

Целью данного исследования явилось научное обоснование необходимости включения в региональные программы массового обследования новорожденных детей исследований методом МС/МС для диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления жирных кислот на основе проведения ретроспективного масс-спектрометрического анализа образцов крови больных детей, заболевания которых закончились летальным исходом на первом году жизни.

Пациенты и методы исследования

В настоящее ретроспективное исследование включены дети (n=86, соотношение мальчики:девочки 48/38), умершие на первом году жизни (в возрасте от 5 суток до 11 месяцев жизни) в течение одного календарного года (2010 год) на административной территории Краснодарского края. В исследование включены дети с врожденными пороками развития (n=29), инфекционными заболеваниями - пневмония, сепсис, бактериальный менингоэнцефалит (n=37), перинатальным поражением ЦНС (n=11), синдромом внезапной смерти (n=6) и иными заболеваниями (n=3). Контрольную группу составили 438 клинически здоровых новорожденных детей (227 девочек, 211 мальчиков) в возрасте 3-8 дней. В данной группе были определены референсные значения концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в капиллярной крови у здоровых детей периода новорожденности.

Материалом для исследования послужили архивные образцы периферической крови на стандартных бумажных тест-бланках, полученные на 3-8 день жизни, для проведения стандартного неонатального скрининга. Концентрацию аминокислот и ацилкарнитинов (табл. 1) в крови определяли методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с помощью квадрупольного тандемного масс-спектрометра Agilent 6410 (AgilentTechnologies, США) по сертифицированной методике компании CHROMSYSTEM № V1 07 05 57136 001. Исследование было выполнено в лаборатории медицинской генетики ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский институт Минздрава России».

Таблица 1

Метаболиты, определяемые методом МС/МС

Метаболит

Условное обозначение

Метаболит

Услов-ное обозна-чение

А м и н о к и с л о т ы

 

1.

Аланин

Ala

21.

3-метилкротонилкарнтин

C5:1

2.

Аспарагиноваякислота

Asp

22.

3-гидроксиизовалерилкарнитин

C5OH

3.

Глутаминоваякислота

Glu

23.

Гексаноилкарнитин

C6

4.

Лейцин+изолейцин

Xle

24.

Октаноилкарнитин

C8

5.

Метионин

Met

25.

Октеноилкарнитин

C8:1

6.

Фенилаланин

Phe

26.

Деканоилкарнитин

C10

7.

Тирозин

Tyr

27.

Деценоилкарнитин

C10:1

8.

Валин

Val

28.

Додеканоилкарнитин

C12

9.

Аргинин

Arg

29.

Миристилкарнитин

C14

10.

Цитруллин

Cit

30.

Тетрадеценоилкарнитин

C14:1

11.

Глицин

Gly

31.

Тетрадециноилкарнитин

C14:2

12.

Орнитин

Orn

32.

Гидроксимиристилкарнтин

C14OH

А ц и л к а р н и т и н ы

33.

Пальмитоилкарнитин

С16

13.

Свободныйкарнитин

C0

34.

Гексадеценоилкарнитин

C16:1

14.

Ацетилкарнитин

C2

35.

Гидроксигексадеценоилкарнитин

C16:1OH

15.

Пропионилкарнитин

C3

36.

Гидроксипальмитоилкарнитин

C16OH

16.

Малонилкарнитин

C3DC

37.

Стеароилкарнитин

C18

17.

Бутирилкарнтин

C4

38.

Олеоилкарнитин

C18:1

18.

Метилмалонилкарнитин

C4DС

39.

Гидроксистеароилкарнитин

C18OH

19.

Изовалерилкарнтин

C5

40.

Гидроксиолеоилкарнитин

C18:1OH

20.

Глутарилкарнитин

C5DC

41.

Гидроксилиноилкарнитин

C18:2OH

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 и электронных таблиц Excel 2007. Для определения описательных числовых характеристик переменных применялись стандартные методики статистического анализа: расчет медианы, 0,5 и 99,5 перцентилей.

Для подтверждающей молекулярно-генетической диагностики лейциноза проводили выделение ДНК из сухих пятен крови, используя набор реактивов DiatomDNAPrep (ООО «Биоком», Россия). Подбор праймеровдля ПЦР амплификации осуществляли для 10 экзонов генов BCKDHA и BCKDHB. Секвенирование ПЦР-фрагментов с целью выявления редких мутаций проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на генетическом анализаторе ABIPrism 3500 (AppliedBiosystem, США).

Результаты исследования и их обсуждение

В результате исследования концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови 438 клинически здоровых новорожденных детей были определены 0,5 и 99,5 перцентиликонцентраций исследованных метаболитов, которые использовались нами в дальнейшем как референсные значения (табл. 2). Сопоставление концентраций аминокислот и ацилкарнитинов, определенных в образцах крови 86 умерших на первом году жизни детей, с референсными значениями концентраций, показало, что у 82 пациентов (95,3 %) ни один из исследуемых показателей не выходил за пределы 0,5 и 99,5 перцентилей контрольной группы, что позволило отказаться от рабочей версии о наличии у них нарушений обмена аминокислот и карнитинов, не верифицированных прижизненно. Однако у 4 детей (4,7 %) концентрации некоторых аминокислот и ацилкарнитиновв несколько раз превышали верхние границы референсного интервала контрольной группы (табл. 2).

Таблица 2

Результаты ретроспективной оценки концентраций аминокислот и ацилкарнитинов у новорожденных (n=4) с уровнем отдельных метаболитов вне диапазона 0,5-99,5 перцентилей

 

 

 

 

Метаболиты

Концентрации отдельных метаболитов (мкмоль/л)

Референсные значения контрольной группы (n= 438)

в диапазоне

0,5-99,5 перцентилей

 

Индивидуальные значения пациентов (n=4) *

 

 

Пациент 1

 

Пациент 2

 

Пациент 3

 

Пациент 4

А м и н о к и с л о т ы

1.

Ala

63,68 - 667,82

77,191

696,2

376,3

1454,7

2.

Asp

25,76 - 226,2

146,482

38,309

192,888

116,147

3.

Glu

262,2 - 1310,89

138,718

239,486

944,055

875,559

4.

Xle

55,4 - 266,92

2503,868

568,038

374,191

476,129

5.

Met

7,02 - 28,99

2,192

39,939

11,595

49,706

6.

Phe

23,09 - 94,94

40,907

138,571

77,324

239,842

7.

Tyr

20,08 - 171,45

16,783

25,600

41,963

204,371

8.

Val

41,53 - 196,87

654,143

351,693

138,619

283,070

9.

Arg

4,93 - 37,75

23,095

88,849

24,646

38,014

10.

Cit

4,75 - 33,57

17,517

10,448

34,673

30,834

11.

Gly

179,3 - 979,0

285,120

312,969

523,159

1457,474

12.

Orn

39,2 - 354,51

31,392

43,233

265,230

139,048

А ц и л к а р н и т и н ы

13.

C0

7,54-69,9

39,077

30,547

31,548

109,293

14.

C2

6,14-63,92

2,448

4,402

5,315

35,754

15.

C3

0,4-4,43

1,114

0,888

0,351

1,494

16.

C3DC

0,023-0,16

0,037

0,013

0,094

0,073

17.

C4

0,06-0,7

0,109

0,187

0,618

1,319

18.

C4DC

0,091-0,56

0,109

0,055

0,177

0,171

19.

C5

0,05-0,39

0,057

0,213

0,483

0,564

20.

C5DC

0,003-0,24

0,023

0,063

0,298

0,334

21.

C5:1

0-0,03

0,014

0,010

0,119

0,027

22.

C5OH

0,047-0,27

0,088

0,066

0,380

0,168

23.

C6

0,008-0,1

0,063

0,030

0,142

0,170

24.

C8

0,016-0,14

0,038

0,024

0,192

0,240

25.

C8:1

0,019-0,12

0,031

0,036

0,049

0,173

26.

C10

0,024-0,21

0,060

0,040

0,177

0,117

27.

C10:1

0,01-0,07

0,014

0,021

0,152

0,149

28.

C12

0,098-1,06

0,139

0,178

0,293

0,176

29.

C14

0,05-0,421

0,085

0,141

0,191

0,129

30.

C14:1

0,04-0,34

0,084

0,083

0,135

0,072

31.

C14:2

0,007-0,04

0,026

0,010

0,028

0,030

32.

C14OH

0,003-0,05

0,008

0,006

0,115

0,021

33.

C16

0,72-6,41

0,404

1,995

1,622

1,499

34.

C16:1

0,031-0,35

0,043

0,158

0,209

0,141

35.

C16:1OH

0,011-0,07

0,020

0,017

0,089

0,032

36.

C16OH

0,01-0,05

0,022

0,011

0,190

0,020

37.

C18

0,24-1,51

0,154

0,287

0,483

0,521

38.

C18:1

0,29-2,34

0,423

0,591

0,776

0,833

39.

C18OH

0,005-0,02

0,006

0,003

0,036

0,003

40.

C18:1OH

0,006-0,03

0,008

0,005

0,063

0,014

41.

C18:2OH

0-0,01

0,003

0,002

0,006

0,002

* Примечание:

Пациент 1 - мальчик КМ (диагноз: обструктивный бронхиолит), умер в возрасте 11 месяцев;

Пациент 2 - мальчик КФ (диагноз: пневмония), умер в возрасте 1 месяца;

Пациент 3 - девочка ЛВ (диагноз: сепсис), умер в возрасте 12 суток.

Пациент 4 - девочка ПА (диагноз: пневмония), умерла в возрасте 6 суток.

В первом случае у пациента КМ, умершего в возрасте 11 месяцев, с диагнозом обструктивный бронхиолит, тандемная масс-спектрометрия аминокислот и ацилкарнитинов в архивных образцах крови выявила изменения содержания лейцина, изолейцина и валина, которые носят достаточно специфический характер, чтобы говорить о высокой вероятности врожденного метаболического дефекта в пути катаболизма лейцина и изолейцина. В исследованных архивных образцах крови обнаружено увеличение концентрации лейцина и изолейцина более чем в 9 раз и валина - более чем в 3 раза по сравнению с референсными значениями, что позволяет предположить диагноз «болезни с запахом мочи кленового сиропа» [1, 2, 4].

Из имеющихся клинических данных в пользу лейциноза у ребенка КМ свидетельствовали следующие клинические проявления: ранний отказ от естественного вскармливания, симптомы неонатальной энцефалопатии, нарастание неврологической симптоматики - изменения мышечного тонуса, судороги, эпилепсия, задержка психомоторного развития. У ребенка часто наблюдались инфекционные заболевания дыхательных путей с тяжелым течением, которые стали причиной облитерирующего бронхиолита, явившегося причиной летального исхода в возрасте 11 месяцев. Мы не обладаем информацией о том, был ли у ребенка специфический запах мочи, но увеличение концентрации типичных для лейциноза метаболитов и характерная клиническая симптоматика подтверждают наше предположение. Кроме того, в пользу диагноза болезни запаха мочи кленового сиропа свидетельствуют результаты проведенной ДНК диагностики лейциноза с использованием архивных образцов крови. Молекулярно-генетический анализ позволил выявить у ребенка делецию с.98delG в первом экзоне гена BCKDHB в гетерозиготном состоянии. Эта же мутация обнаружена в крови матери. Ввиду ограниченного количества архивных образцов крови ребенка и недоступности биологического материала его отца вторую мутацию обнаружить не удалось. Тем не менее, совокупность клинических, биохимических и молекулярно-генетических данных подтверждают диагноз лейциноза (или болезни с запахом мочи кленового сиропа, MIM ID 248600) в изученном случае.

В остальных трех случаях выявленные изменения профиля аминокислот и ацилкарнитинов не носят такого же специфического характера, как в предыдущем случае. Предполагать определенные НБО, основываясь на данных МС/МС,тем более - утверждать с достоверностью, в этих случаях невозможно. Для дифференциальной диагностики аминоацидопатий и органических ацидурий необходимы были бы повторные исследования крови методом МС/МС, дополнительные клинические и биохимические исследования.

Степень повышения специфичных для заболеваний метаболитов вариабельна и зависит от многих факторов. Характер питания ребенка, прием некоторых лекарственных препаратов должны учитываться при интерпретации результатов. Так, прием препаратов, содержащих вальпроевую кислоту или среднецепочечные триглицериды, приводит к повышению С6, С8 и С10, что затрудняет диагностику недостаточности среднецепочечной ацил-КоАдегидрогеназы. Прием карнитинсодержащих лекарственных препаратов также может приводить к повышению концентраций коротко- и среднецепочечных ацилкарнитинов. Содержание длинноцепочечных ацилкарнитинов в плазме и цельной крови различно, поскольку они ассоциированы с мембранами эритроцитов, следовательно, показатель гематокрита имеет определенное значение. За некоторым исключением, полутора - двукратное увеличение концентрации требует повторного анализа крови. Так, патогномоничные для пропионовой и изовалериановой ацидурии уровни метаболитов обычно повышаются более чем в 5 раз, а даже незначительное изменение концентрации глутарилкарнитина требует не только повторного анализа крови, но и дополнительного исследования органических кислот мочи, характерных для глутаровой ацидурии I типа [6, 7].

Заключение

Проведенное методом МС/МС ретроспективное исследование образцов крови детей раннего возраста, умерших от различных причин, позволило предположить в ряде случаев наследственную патологию обмена веществ. В одном из них подтвержден диагноз болезни запах мочи кленового сиропа (лейциноз). Своевременные диагностические мероприятия в подобных случаях являются важной составляющей в дифференциальной диагностике врожденных ошибок метаболизма. Исследование концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в образцах биологических жидкостей может иметь диагностическую ценность в анализе случаев младенческой смертности. Посмертно установленный диагноз наследственного заболевания обмена веществ у умершего ребенка является показанием для медико-генетического консультирования семьи. Необходимо широкое внедрение метода МС/МС в неонатальный скрининг как основного инструмента для выявления аминоацидопатий, органических ацидемий и дефектов β-митохондриального окисления жирных кислот у новорожденных для своевременной диагностики и лечения НБО.

Рецензенты:

Полевиченко Елена Владимировна, д-р мед. наук, профессор, главный научный сотрудник отдела реабилитации и медико-социальной помощи ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России, г. Москва.

Михайлова Светлана Витальевна, д-р мед. наук, заведующая отделением медицинской генетики ФГБУ «Российская детская клиническая больница Минздрава России», г. Москва.


Библиографическая ссылка

Байдакова Г.В., Антонец А.В., Голихина Т.А., Матулевич С.А., Амелина С.С., Куцев С.И., Куцев С.И. РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 2.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=8953 (дата обращения: 25.05.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252