Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,813

DEVELOPMENT AND VALIDATION OF THE ARBUTIN QUALITATIVE ANALYSIS IN COWBERRIES LEAVES AND BEARBERRY LEAVES USING THE CAPILLARY ELECTROPHORESIS METHOD

Roznyatovskaya A.A. 1 Senchenko S.P. 1 Kharakhashyan A.A. 2
1 Pyatigorsk medico-pharmaceutical institute – branch to Volgograd State Medical University
2 The Rostov State Medical University
Представлены результаты разработки методикиколичественного определения арбутина в брусники листьях (Vitis – idaeaefolia) и толокнянки листьях (Uvaeursifolia) методом капиллярного электрофореза. Показано, что использование боратного электролита с рН 9,0 является достаточным для ионизации арбутина. При этом рабочие параметры были следующие: кварцевый капилляр диаметром 50 мкм с эффективной длинной 65 см; детектирование осуществлялось спектрофотометрически при 254 нм; напряжение составляло 20 кВ. В указанных условиях удалось достигнуть приемлемого разделения арбутина с сопутствующими компонентами сырья. Разработанная методика была подвергнута процедуре валидации по показателям: линейность, прецизионность и правильность. С использование разработанной и валидированной методики установлено следующее содержание арбутина в сырье: брусники листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80614) – 6,21%±0,27, толокнянки листья (ОАО«Красногорсклексредства», серия 80714) – 14,49%±0,54.
The results of development of the method for qualitative analysis of arbutin in cowberry leaves and bearberry leaves using the capillary electrophoresis method have been represented. It has been shown that the use of borate electrolyte with рН 9.0 is enough for arbutin ionization. At that, the operational characteristics were as follows: the quartz capillary with the diameter of 50 microns with the effective length of 65 cm; the detection was done in the spectrum photometric way at 254 nanometers; the voltage was 20 kV. In the indicated conditions, it proved to be possible to reach acceptable separation of arbutin and the accompanying raw material components. The developed method has been validated using the following characteristics: linearity, precision and accuracy. Using the developed and validated method, the following content of arbutin in the raw material has been determined: 6.21%±0,27 of cowberry leaves (OAO Krasnogorskleksredstva, series 80614), 14.49%±0.54 of bearberry leaves (OAO Krasnogorskleksredstva, series 80714).
cowberry leaves
bearberry leaves
capillary electrophoresis
arbutin

На сегодняшний день неотъемлемой частью номенклатуры лекарственных средств назначаемых в комплексной терапии воспалительных заболеваний мочевого пузыря и мочевыводящих путей (циститы, уретриты) является лекарственное растительное сырье, основные из которых это брусники листья (Vitis – idaeae folia) и толокнянки листья (Uvae ursi folia). Мочегонные и уроантисептические свойства данных растительных объектов связаны в первую очередь с фенольными гликозидами арбутином и метиларбутином, а также с гидрохиноном и его метиловым эфиром [1].

Согласно нормативной документации на данные виды сырья, содержание арбутина в них должно быть не менее 6 % (толокнянки листья) и 4,5 % (брусники листья).

Следует сказать, что все нормативные документы на указанные виды сырья в качестве методики количественного определения арбутина предлагают использовать окислительно-восстановительное титрование йодом. Важно также отметить, что методика обременена сложными процедурами пробоподготовки и очистки, занимающими длительное время и невольно приводящими к возрастанию случайной погрешности. Кроме того, в итоге осуществляется титрование не только арбутина, а некоего комплекса, близких по химическим свойствам, веществ, что также не позволяет оценить истинное содержание арбутина.

Решение указанных вопросов возможно с использованием сепарационных методов анализа (ВЭЖХ, капиллярного электрофореза (КЭ)). И на сегодняшний день известно ряд ВЭЖХ-методик количественного определения арбутина в сырье [2-4]. В то же время использование КЭ может быть более оправданным, поскольку не требуется дорогостоящих растворителей и колонок. Кроме того, наличие более высоких параметров эффективности является ключевым преимуществом при анализе сложных растительных объектов, содержащих десятки, а порой и сотни соединений.

Цель работы

Разработка и валидация методики количественного определения арбутина в толокнянки листьях и брусники листьях с применением капиллярного электрофореза.

Материалы и методы исследования

Для исследования использовали стандартный образец (СО) арбутина (Sigma, с содержанием не менее 98%), а так же образцы сырья толокнянки листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80714) и брусники листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80614).

Работу проводили с использованием системы капиллярного электрофореза Капель 103 Р (группа компаний Люмэкс, Россия) с кварцевым капилляром диаметром 50 мкм, общей длинной 75 см и эффективной длинной 65 см. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при 254 нм в катодной области капилляра. Напряжение составляло 20 кВ (блок положительной полярности). Для подготовки капилляра и восстановления его поверхности проводили его последовательную промывку водой, 0,5 М раствором кислоты хлористоводородной, водой, 0,5 М раствором натрия гидроксида, водой и затем ведущим электролитом.

В работе реализовывался вариант зонного электрофореза, где в качестве ведущего электролита использовали 0,01М боратный буферный раствор с рН 9,0. Выбор электролита связан с тем, что при данном значении рН, арбутин ионизируется по фенольному гидроксилу (Рисунок 1), являясь при этом заряженной частицей.

Рисунок 1. Зависимость степени ионизации арбутина от рН среды (по данным http://www.chemicalize.org).

Важно отметить, что при данном значении рН электролита арбутин ионизирован всего на 13 %, однако даже в этих условиях он обладает, хоть и незначительной, эффективной электрофоретической подвижностью.

Извлечение арбутина из сырья проводили в соответствии с методикой, приведенной в нормативной документации на анализируемое лекарственное растительное сырье. Для этого точную навеску (около 0,5 г) сырья помещали в коническую колбу вместимостью 100мл, заливали 50 мл воды и присоединяли к обратному холодильнику. Нагревание вели на плитке, поддерживая слабое кипение, в течение 30 минут. Горячее извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр диаметром 7 см. В колбу с сырьем повторно прибавляли 25 мл воды и кипятили в течение 20 минут. Повторное горячее извлечение фильтровали, объединяя извлечения. Остаток на фильтре промывали 20 мл горячей воды, также объединяя все извлечения. После охлаждения раствор доводили до метки водой и перемешивали. Далее 1 мл полученного раствора центрифугировали 5 мин при 8000 мин-1 и подвергали его анализу.

Результаты исследования и их обсуждение

На рисунках 2-4 представлены электрофореграммы раствора СО арбутина, а также извлечений брусники листьев и толокнянки листьев.

Рисунок 2. Электрофореграмма раствора СО арбутина

Рисунок 3. Электрофореграмма извлечения брусники листьев

Рисунок 4. Электрофореграмма извлечения толокнянки листьев

В результате в обоих видах сырья было установлено наличие арбутина. При этом коэффициент его разделения с сопутствующими компонентами пробы был достаточным для его количественного определения.

Следующим этапом исследований была валидационная оценка разработанной методики по показателям: линейность, прецизионность и правильность.

Линейность методики определялась по итогам анализа серии растворов СО арбутина различной концентрации (от 0,0051 до 0,0816 г/100мл). На рисунке 5 представлен градуировочный график зависимости площади пика арбутина от его концентрации в растворе. Полученная зависимость имеет линейный характер и описывается следующим уравнением: y=6,1873x-0,002. При этом коэффициент корреляции (r) был равен 0,999995, что позволяет использовать данное уравнение для количественного определения арбутина в указанном диапазоне концентраций.

Рисунок 5. Градуировочный график зависимости площади пика от концентрации арбутина в растворе

Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 6 параллельных определений для каждого образца сырья. Расчет содержания (%) проводили по уравнению градуировочного графика арбутина, в пересчете на воздушно сухое сырье. Результаты оценки прецизионности методики количественного определения арбутина в брусники листьях и толокнянки листьях приведены в таблице 1-2.

Таблица 1

Результаты оценки прецизионности методики количественного определения арбутина в брусники листьях

Навеска, г

Площадь пика, S

Содержание, %

Характеристики

0,4999

0,167

6,28

Хср = 6,21 %

SD= 0,27

RSD= 4,26%

0,5013

0,173

6,47

0,5069

0,165

6,12

0,5222

0,162

5,83

0,5119

0,165

6,04

0,5017

0,174

6,52

Таблица 2

Результаты оценки прецизионности методики количественного определения арбутина в толокнянки листьях

Навеска, г

Площадь пика, S

Содержание, %

Характеристики

0,5106

0,416

15,21

Хср = 14,49 %

SD = 0,54

RSD= 3,73 %

0,5102

0,403

14,75

0,5030

0,389

14,44

0,5041

0,3715

13,76

0,5006

0,396

14,77

0,5101

0,382

13,98

Полученные результаты свидетельствуют о приемлемых значениях случайной погрешности, что свидетельствует о валидности методики по данному показателю.

Изучение правильности методики проводили путем анализа 9 образцов каждого сырья на трех уровнях концентраций. Оценку правильности методики проводили по открываемости (R, %). Результаты данной оценки представлены в таблице 3-4.

Таблица 3

Результаты оценки правильности методики количественного определения арбутина в брусники листьях

№ п/п

Уровень

Навеска, г

Теоретическое содержание арбутина в навеске сырья, мг

Найденное содержание арбутина в навеске сырья, мг

Открываемость (R), %

Характеристики

1

1

0,3527

21,90

21,55

98,40

Rср = 100,57%

SD = 3,26

RSD = 3,24%

2

1

0,3502

21,75

21,75

100,00

3

1

0,3720

23,10

24,70

106,93

4

2

0,4999

31,04

31,39

101,13

5

2

0,5013

31,13

32,43

104,18

6

2

0,5069

31,48

31,02

98,54

7

3

0,6510

40,43

39,91

98,71

8

3

0,6572

40,81

41,21

100,98

9

3

0,6520

40,49

38,99

96,30

Таблица 4

Результаты оценки правильности методики количественного определения арбутина в толокнянки листьях

№ п/п

Уровень

Навеска, г

Теоретическое содержание арбутина в навеске сырья, мг

Найденное содержание арбутина в навеске сырья, мг

Открываемость (R), %

Характеристики

1

1

0,3528

51,12

51,31

100,37

Rср = 100,17%

SD = 3,71

RSD = 3,71%

2

1

0,3580

51,87

50,83

98,00

3

1

0,3679

53,31

51,21

96,06

4

2

0,5041

73,04

70,09

95,96

5

2

0,5006

72,54

73,94

101,93

6

2

0,5101

73,91

71,31

96,48

7

3

0,6597

98,59

101,08

102,53

8

3

0,6555

94,98

99,96

105,24

9

3

0,6548

94,88

99,59

104,96

Полученные результаты свидетельствуют, что значения открываемости для обоих веществ находятся в пределах 98 – 102%, что согласно общепринятым рекомендациям [5] свидетельствует о валидности методики по данному показателю.

С использованием разработанной и валидированной методики были получены следующие результаты количественного содержания арбутина в изучаемых образцах. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты количественного определения арбутина в брусники листьях и в толокнянки листьях

Образец

Содержание арбутина, % ±SD

Толокнянки листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80714)

14,49±0,54

Брусники листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80614)

6,21±0,27

Полученные данные свидетельствуют о значительном содержании арбутина в изучаемых образцах. Кроме того, имеет место явное занижение нормативных показателей по содержанию арбутина в сырье, особенно в случае с толокнянки листьями.

Выводы

Разработана методика количественного определения арбутина в толокнянки листьях и брусники листьях с использованием капиллярного электрофореза. Разработанная методика была валидирована по основным показателям, что подтверждает возможность ее использования для количественного определения арбутина в указанном сырье.

Рецензенты:

Компанцева Е.В., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии ПМФИ – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск.

Оганесян Э.Т., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой органической химии ПМФИ – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск.