Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АРБУТИНА В БРУСНИКИ ЛИСТЬЯХ И ТОЛОКНЯНКИ ЛИСТЬЯХ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Рознятовская А.А. 1 Сенченко С.П. 1 Харахашян А.А. 2
1 Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России
2 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России
Представлены результаты разработки методикиколичественного определения арбутина в брусники листьях (Vitis – idaeaefolia) и толокнянки листьях (Uvaeursifolia) методом капиллярного электрофореза. Показано, что использование боратного электролита с рН 9,0 является достаточным для ионизации арбутина. При этом рабочие параметры были следующие: кварцевый капилляр диаметром 50 мкм с эффективной длинной 65 см; детектирование осуществлялось спектрофотометрически при 254 нм; напряжение составляло 20 кВ. В указанных условиях удалось достигнуть приемлемого разделения арбутина с сопутствующими компонентами сырья. Разработанная методика была подвергнута процедуре валидации по показателям: линейность, прецизионность и правильность. С использование разработанной и валидированной методики установлено следующее содержание арбутина в сырье: брусники листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80614) – 6,21%±0,27, толокнянки листья (ОАО«Красногорсклексредства», серия 80714) – 14,49%±0,54.
брусники листья
толокнянки листья
капиллярный электрофорез
арбутин
1. Толокнянка обыкновенная Arctostaphylosuva-ursi (L.) Spreng. Р. В. Куцик, Б. М. Зузук., А.Т. Недоступ, Т. Пецко. Провизор Выпуск №18 2003 (http://www.provisor.com.ua/archive/2003/N18/art_27.php).
2. Моисеев Д.В. Кинетика реакции деструкции арбутина в листьях брусники обыкновенной при хранении в естественных и стрессовых условиях // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье».2013. №2. С. 106-111.
3. Thongchai W, Liawruangrath B, Liawruangrath S. High-performance liquid chromatographic determination of arbutin in skin-whitening creams and medicinal plant extracts.// J Cosmet Sci.2007. Jan-Feb;58(1). P. 35-44.
4. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище.—М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.—240 с.
5. Guidelines for standard method performance requirements. − [Электронный ресурс]. − Режим доступа:http://www.aoac.org/imis15_prod/AOAC_Docs/StandardsDevelopment/eoma_appendix_f.pdf.

На сегодняшний день неотъемлемой частью номенклатуры лекарственных средств назначаемых в комплексной терапии воспалительных заболеваний мочевого пузыря и мочевыводящих путей (циститы, уретриты) является лекарственное растительное сырье, основные из которых это брусники листья (Vitis – idaeae folia) и толокнянки листья (Uvae ursi folia). Мочегонные и уроантисептические свойства данных растительных объектов связаны в первую очередь с фенольными гликозидами арбутином и метиларбутином, а также с гидрохиноном и его метиловым эфиром [1].

Согласно нормативной документации на данные виды сырья, содержание арбутина в них должно быть не менее 6 % (толокнянки листья) и 4,5 % (брусники листья).

Следует сказать, что все нормативные документы на указанные виды сырья в качестве методики количественного определения арбутина предлагают использовать окислительно-восстановительное титрование йодом. Важно также отметить, что методика обременена сложными процедурами пробоподготовки и очистки, занимающими длительное время и невольно приводящими к возрастанию случайной погрешности. Кроме того, в итоге осуществляется титрование не только арбутина, а некоего комплекса, близких по химическим свойствам, веществ, что также не позволяет оценить истинное содержание арбутина.

Решение указанных вопросов возможно с использованием сепарационных методов анализа (ВЭЖХ, капиллярного электрофореза (КЭ)). И на сегодняшний день известно ряд ВЭЖХ-методик количественного определения арбутина в сырье [2-4]. В то же время использование КЭ может быть более оправданным, поскольку не требуется дорогостоящих растворителей и колонок. Кроме того, наличие более высоких параметров эффективности является ключевым преимуществом при анализе сложных растительных объектов, содержащих десятки, а порой и сотни соединений.

Цель работы

Разработка и валидация методики количественного определения арбутина в толокнянки листьях и брусники листьях с применением капиллярного электрофореза.

Материалы и методы исследования

Для исследования использовали стандартный образец (СО) арбутина (Sigma, с содержанием не менее 98%), а так же образцы сырья толокнянки листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80714) и брусники листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80614).

Работу проводили с использованием системы капиллярного электрофореза Капель 103 Р (группа компаний Люмэкс, Россия) с кварцевым капилляром диаметром 50 мкм, общей длинной 75 см и эффективной длинной 65 см. Детектирование осуществляли спектрофотометрически при 254 нм в катодной области капилляра. Напряжение составляло 20 кВ (блок положительной полярности). Для подготовки капилляра и восстановления его поверхности проводили его последовательную промывку водой, 0,5 М раствором кислоты хлористоводородной, водой, 0,5 М раствором натрия гидроксида, водой и затем ведущим электролитом.

В работе реализовывался вариант зонного электрофореза, где в качестве ведущего электролита использовали 0,01М боратный буферный раствор с рН 9,0. Выбор электролита связан с тем, что при данном значении рН, арбутин ионизируется по фенольному гидроксилу (Рисунок 1), являясь при этом заряженной частицей.

Рисунок 1. Зависимость степени ионизации арбутина от рН среды (по данным http://www.chemicalize.org).

Важно отметить, что при данном значении рН электролита арбутин ионизирован всего на 13 %, однако даже в этих условиях он обладает, хоть и незначительной, эффективной электрофоретической подвижностью.

Извлечение арбутина из сырья проводили в соответствии с методикой, приведенной в нормативной документации на анализируемое лекарственное растительное сырье. Для этого точную навеску (около 0,5 г) сырья помещали в коническую колбу вместимостью 100мл, заливали 50 мл воды и присоединяли к обратному холодильнику. Нагревание вели на плитке, поддерживая слабое кипение, в течение 30 минут. Горячее извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр диаметром 7 см. В колбу с сырьем повторно прибавляли 25 мл воды и кипятили в течение 20 минут. Повторное горячее извлечение фильтровали, объединяя извлечения. Остаток на фильтре промывали 20 мл горячей воды, также объединяя все извлечения. После охлаждения раствор доводили до метки водой и перемешивали. Далее 1 мл полученного раствора центрифугировали 5 мин при 8000 мин-1 и подвергали его анализу.

Результаты исследования и их обсуждение

На рисунках 2-4 представлены электрофореграммы раствора СО арбутина, а также извлечений брусники листьев и толокнянки листьев.

Рисунок 2. Электрофореграмма раствора СО арбутина

Рисунок 3. Электрофореграмма извлечения брусники листьев

Рисунок 4. Электрофореграмма извлечения толокнянки листьев

В результате в обоих видах сырья было установлено наличие арбутина. При этом коэффициент его разделения с сопутствующими компонентами пробы был достаточным для его количественного определения.

Следующим этапом исследований была валидационная оценка разработанной методики по показателям: линейность, прецизионность и правильность.

Линейность методики определялась по итогам анализа серии растворов СО арбутина различной концентрации (от 0,0051 до 0,0816 г/100мл). На рисунке 5 представлен градуировочный график зависимости площади пика арбутина от его концентрации в растворе. Полученная зависимость имеет линейный характер и описывается следующим уравнением: y=6,1873x-0,002. При этом коэффициент корреляции (r) был равен 0,999995, что позволяет использовать данное уравнение для количественного определения арбутина в указанном диапазоне концентраций.

Рисунок 5. Градуировочный график зависимости площади пика от концентрации арбутина в растворе

Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 6 параллельных определений для каждого образца сырья. Расчет содержания (%) проводили по уравнению градуировочного графика арбутина, в пересчете на воздушно сухое сырье. Результаты оценки прецизионности методики количественного определения арбутина в брусники листьях и толокнянки листьях приведены в таблице 1-2.

Таблица 1

Результаты оценки прецизионности методики количественного определения арбутина в брусники листьях

Навеска, г

Площадь пика, S

Содержание, %

Характеристики

0,4999

0,167

6,28

Хср = 6,21 %

SD= 0,27

RSD= 4,26%

0,5013

0,173

6,47

0,5069

0,165

6,12

0,5222

0,162

5,83

0,5119

0,165

6,04

0,5017

0,174

6,52

Таблица 2

Результаты оценки прецизионности методики количественного определения арбутина в толокнянки листьях

Навеска, г

Площадь пика, S

Содержание, %

Характеристики

0,5106

0,416

15,21

Хср = 14,49 %

SD = 0,54

RSD= 3,73 %

0,5102

0,403

14,75

0,5030

0,389

14,44

0,5041

0,3715

13,76

0,5006

0,396

14,77

0,5101

0,382

13,98

Полученные результаты свидетельствуют о приемлемых значениях случайной погрешности, что свидетельствует о валидности методики по данному показателю.

Изучение правильности методики проводили путем анализа 9 образцов каждого сырья на трех уровнях концентраций. Оценку правильности методики проводили по открываемости (R, %). Результаты данной оценки представлены в таблице 3-4.

Таблица 3

Результаты оценки правильности методики количественного определения арбутина в брусники листьях

№ п/п

Уровень

Навеска, г

Теоретическое содержание арбутина в навеске сырья, мг

Найденное содержание арбутина в навеске сырья, мг

Открываемость (R), %

Характеристики

1

1

0,3527

21,90

21,55

98,40

Rср = 100,57%

SD = 3,26

RSD = 3,24%

2

1

0,3502

21,75

21,75

100,00

3

1

0,3720

23,10

24,70

106,93

4

2

0,4999

31,04

31,39

101,13

5

2

0,5013

31,13

32,43

104,18

6

2

0,5069

31,48

31,02

98,54

7

3

0,6510

40,43

39,91

98,71

8

3

0,6572

40,81

41,21

100,98

9

3

0,6520

40,49

38,99

96,30

Таблица 4

Результаты оценки правильности методики количественного определения арбутина в толокнянки листьях

№ п/п

Уровень

Навеска, г

Теоретическое содержание арбутина в навеске сырья, мг

Найденное содержание арбутина в навеске сырья, мг

Открываемость (R), %

Характеристики

1

1

0,3528

51,12

51,31

100,37

Rср = 100,17%

SD = 3,71

RSD = 3,71%

2

1

0,3580

51,87

50,83

98,00

3

1

0,3679

53,31

51,21

96,06

4

2

0,5041

73,04

70,09

95,96

5

2

0,5006

72,54

73,94

101,93

6

2

0,5101

73,91

71,31

96,48

7

3

0,6597

98,59

101,08

102,53

8

3

0,6555

94,98

99,96

105,24

9

3

0,6548

94,88

99,59

104,96

Полученные результаты свидетельствуют, что значения открываемости для обоих веществ находятся в пределах 98 – 102%, что согласно общепринятым рекомендациям [5] свидетельствует о валидности методики по данному показателю.

С использованием разработанной и валидированной методики были получены следующие результаты количественного содержания арбутина в изучаемых образцах. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты количественного определения арбутина в брусники листьях и в толокнянки листьях

Образец

Содержание арбутина, % ±SD

Толокнянки листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80714)

14,49±0,54

Брусники листья (ОАО «Красногорсклексредства», серия 80614)

6,21±0,27

Полученные данные свидетельствуют о значительном содержании арбутина в изучаемых образцах. Кроме того, имеет место явное занижение нормативных показателей по содержанию арбутина в сырье, особенно в случае с толокнянки листьями.

Выводы

Разработана методика количественного определения арбутина в толокнянки листьях и брусники листьях с использованием капиллярного электрофореза. Разработанная методика была валидирована по основным показателям, что подтверждает возможность ее использования для количественного определения арбутина в указанном сырье.

Рецензенты:

Компанцева Е.В., д.фарм.н., профессор кафедры фармацевтической и токсикологической химии ПМФИ – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск.

Оганесян Э.Т., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой органической химии ПМФИ – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г. Пятигорск.


Библиографическая ссылка

Рознятовская А.А., Сенченко С.П., Харахашян А.А. РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АРБУТИНА В БРУСНИКИ ЛИСТЬЯХ И ТОЛОКНЯНКИ ЛИСТЬЯХ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА // Современные проблемы науки и образования. – 2014. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=16982 (дата обращения: 21.08.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252