Цель исследования
Цель исследования - изучение состояния системы гемостаза и микрогемодинамики в летний и зимний сезоны года в условиях экспериментальной ожоговой травмы, и возможности коррекции нарушений с использованием комплексных фитоадаптогенов.
Материалы и методы исследования
Показатели свертывания крови и микроциркуляцию изучали в 3-х группах животных, в каждой из которых было по 24 крыс-самцов линии Вистар весом 200-250 г, по 8 голов в серии. Исследования проводили в 1, 7 и 21 сутки после ЭОТ в зимний и летний сезоны года: 1 группа - животные с экспериментальной ожоговой травмой (серии 4-6), 2 и 3 - животные с коррекцией нарушений фитококтейлями «Биоритм-Э» и «Биоритм-РС» (серии 7-9 и 10-12) в течение 21 суток после травмы. Полученные результаты сравнивали с данными интактных крыс (серия 1, n=10) и с фоновым приемом обоих фитококтейлей (серии 2 и 3, по 10 голов в серии).
Животных содержали при естественном освещении со свободным доступом к пище и воде ad libitum. Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных (1986) и правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 708 от 23.08.2010). В соответствии с теорией «постоянного внутрисосудистого свертывания крови» [4], подчиненного законам биологических ритмов, для охвата суточных колебаний процесса агрегации тромбоцитов, забор крови под тиопенталовым наркозом из сердца производили в течение двух последовательных суток в одно и тоже время (в 8.00; 12.00; 16.00 и 20.00 часов), то есть по 8 измерений в серии, с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в системе гемостаза [1].
Ожоговую травму создавали контактным способом, нанося ожог разогретой медной пластиной на 2-3 участках предварительно эпилированной кожи спины под тиопенталовым наркозом, что обеспечивало поражение 10-15% кожной поверхности. Экспозиция для получения ожогов III-IV степени составляла 10-15 секунд. Использованная модель экспериментальной ожоговой травмы сопровождается развитием гиперкоагуляционного синдрома с явлениями хронического ДВС-синдрома [3].
Широко распространенные в настоящее время различные лабораторные тесты для оценки свертывания, основанные на измерении времени свертывания, разнообразные методы коррекции нарушений в системах гемостаза и МЦ, не могут оценить тенденцию к тромбозам и субклинические нарушения в исследовании гемокоагуляции. В ситуации, когда «локальные» тесты демонстрируют разнообразные варианты патологии, «глобальные», основанные на характеристиках свертывания цельной крови, могут отражать нормальный «гемостатический потенциал» ввиду «скомпенсированности» звеньев системы гемостаза (СГ) и микроциркуляции (МЦ), таким образом, оценка характеристики свертывания цельной крови - важный метод диагностики «текущего» статуса. Таким «глобальным» тестом в исследовании стала гемокоагулография (электрокоагулография) с использованием коагулографов Н-333 и Н-334. Среди показателей электрокоагулографии (ЭКоГ) оценивали время начала (Т1), продолжительности (Т), конца (Т2), скорости (Vc) свертывания, время начала фибринолиза (Т3). Методом агрегатометрии оценивали показатели АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов (СкА - скорость агрегации, ВА - время агрегации, СтА - степень агрегации), показатели микроциркуляции методом ультразвуковой допплерографии (М - средняя, S - систолическая, D - диастолическая скорости кровотока) и показатели плазменного гемостаза методом коагулометрии (АЧТВ, ПВ, ТВ, фибриноген, РФМК).
В работе использовали фитококтейли (ФК) «Биоритм-Э» (БР-Э) (товарный знак (ТЗ) №2010734191 от 18.10.2011) и «Биоритм-РС» (БР-РС) (ТЗ №2010734192 от 20.10.2011), которые составляли из смеси спиртовых экстрактов в определенных пропорциях - элеутерококка колючего, родиолы розовой, солодки голой, девясила высокого. Фитококтейли созданы и апробированы в лаборатории традиционной медицины Института биомедицинских исследований [9]. В течение недели перед применением фитококтейл замерялось суточное потребление воды в пересчете на 100 г массы тела крысы. В концентрации, рассчитанной, исходя из среднесуточного объема потребляемой жидкости, фитококтейль добавлялся в поилки. Дозировка адаптогенов рассчитывалась, исходя из рекомендаций в инструкции по применению препарата с учетом коэффициента (х10) для мелких лабораторных животных и составляла 0,05 мл на 100 г массы тела в сутки (растворитель - питьевая вода). В проведенных ранее исследованиях было показано отсутствие статистически значимых отличий к контролю из интактных крыс при курсовом приеме спирта (растворителя для ФК) в указанной дозе.
Статистическую обработку проводили с использованием методов непараметрической статистики (т.к. большинство показателей не подчинялись закону нормального распределения) с помощью электронных таблиц Excel 2010 с настройкой AtteStat, пакетов программ Statistica 8.0. Результаты представлены в виде медианы и доверительных интервалов (25 и 75 перцентилей).
Результаты исследования
Анализ сезонных изменений электрокоагулограммы демонстрирует торможение свертывания цельной крови в летний сезон года на фоне более высокой фибринолитической активности (табл. 1-2). Курсовой прием обоих фитококтейлей способствует развитию гипокоагулирующих тенденций на фоне статистически значимой активации фибринолиза (укорочение Т3), скорость свертывания также снижается, более значимые изменения характеризуют эффекты «Биоритм-РС».
На фоне ожоговой травмы в зимний сезон года на фоне более широкого доверительного интервала сезонного контроля отмечено статистически значимое укорочение времени начала свертывания (Т1) в 1-е сутки в 2 раза с последующей нормализацией показателя к 7 суткам (серии 4-6). На фоне лечения фитококтейлями отмечается тенденция к удлинению показателя к 21 суткам. Летом при ожоге в эксперименте отмечена тенденция к ускорению показателя, однако границы доверительных интервалов серий значительно расширены.
Зимой время окончания свертывания (Т2) при ЭОТ укорачивается почти в 2 раза к сезонному контролю, тенденция к восстановлению отмечена уже с 7-х суток, к 21-м - зна-чение показателя восстанавливается. Лечебный прием комплексных фитоадаптогенов уже на 7-е сутки нормализует показатель, особенно при приеме «Биоритм-РС». Летом при ожоговой травме тенденция к нормализации Т2 отмечена к 21-м суткам опыта. При лечебном приеме большую эффективность также демонстрирует БР-РС, нормализуя показатель уже на 7- сутки ожога (р<0,05).
Зимой - продолжительность свертывания (Т) при ожоге укорачивается в 3,6 раз к сезонному контролю, демонстрируя явление гиперкоагуляции, показатель восстанавливается к 21-м суткам. Лечебный прием обоих фитококтейлей уже на 7-е сутки приводит к нормализации показателя. Летом степень гиперкоагуляции по показателю продолжительности свертывания (Т) выражена меньше - на 48% (в зимний сезон на 72,2%). Лечебный прием фитококтейлей сопровождаются нормализующими тенденциями (табл. 1-2).
Таблица 1
Показатели электрокоагулографии (зима)
|
Показатели |
Интактные крысы |
Курсовой прием ФК |
ЭОТ (сутки) |
|||
|
БР-Э |
БР-РС |
1 |
7 |
21 |
||
|
серии |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
Т1, сек
|
45 (39; 53,5) |
57,5 (52,5; 63,5) |
57 (53; 61,5) |
25 р1-3 (22; 26,5) |
38 (33,5; 46,5) |
42 р2-3 (39; 48) |
|
Т2, сек
|
148 (144,5; 158) |
163,5 (160,5; 170) |
178 р1 (171,5; 183) |
70 р1-3 (60; 84) |
108 р2,3 (101,5; 123,5) |
144 р2 (138; 152,5) |
|
Т, сек
|
99 (93,5; 115,5) |
120,5 (111; 136,5) |
130,5 р1,2 (124; 141,5) |
27,5 р1-3 (18,5; 42,5) |
56 р2,3 (52; 71) |
89 р2,3 (87,5; 100,5) |
|
Vc, усл.ед. |
1,7 (1,35; 2,4) |
1,65 (1,5; 1,75) |
1,35 (1,25; 1,55) |
2,15 р1,3 (1,85; 2,25) |
1,3 (1,2; 1,5) |
1,5 (1,45; 1,6) |
|
Т3, сек |
13,9 (11,4; 15,8) |
10,3 р1 (9,7; 12,9) |
8,1 р2 (7,2; 9,5) |
- |
- |
16,5 (16,3; 16,55) |
|
Введение ФК в течение 21 суток после ЭОТ |
||||||
|
Серии |
БР-Э |
БР-РС |
||||
|
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
|
сутки |
1 |
7 |
21 |
1 |
7 |
21 |
|
Т1, сек
|
32,5 р1,2,4 (27,5; 35) |
51,5 (40; 54) |
55 (40; 62,5) |
35 р2 (30; 45) |
61 (57,5; 65) |
65 (60; 75) |
|
Т2, сек
|
65 р1-3 (64; 70) |
130 р1-3 (125; 132,5) |
147,5 р2 (140; 157,5) |
65 р1-3 (60; 67,5) |
157,5 р3,5 (145; 162,8) |
157,5 (147,5; 165) |
|
Т, сек
|
35 р1-3 (31,5; 40) |
81 р2,3,5 (73,5; 92,5) |
92,5 р2 (85; 105) |
25 р1-3 (20; 37,5) |
92,5 р3 (82,5; 101,8) |
90 р3 (80; 105) |
|
Vc, усл.ед.
|
1,9 р1 (1,8; 2,1) |
1,55 р3 (1,5; 1,65) |
1,25 (1,18; 1,45) |
1,85 р1 (1,7; 2,15) |
1,0 (1,45; 1,6) |
1,45 (1,3; 1,5) |
|
Т3, сек |
- |
12,8 (11,1; 14,6) |
12,5 (9,4; 12,6) |
- |
14,6 (14,3; 15,6) |
9,9 (8,5; 13,2) |
Примечание: результаты представлены в виде медианы, 25-й и 75-й перцентилей, р - уровень значимости по результатам непараметрического анализа между сериями эксперимента; ЭОТ - экспериментальная ожоговая травма, ФК - фитококтейль, * - отсутствие достоверности.
Таблица 2
Показатели электрокоагулографии (лето)
|
Показатели |
Интактные крысы |
Курсовой прием ФК |
ЭОТ (сутки) |
|||
|
БР-Э |
БР-РС |
1 |
7 |
21 |
||
|
серии |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
|
Т1, сек
|
80,0*р (75; 85) |
83,5*р (78; 87) |
96,0*р (88,5; 100) |
58,5 р3 (48; 67,5) |
65,0 (57; 79,5) |
73,5 (64,5; 76,5) |
|
Т2, сек
|
184,0*р (172; 197,5) |
196,0*р (176; 209) |
204,0*р (189,5; 232,5) |
118,5 р1-3 (106,5; 128,5) |
124,5 р1-4 (116,5; 130,5) |
165,0 р3 (153,5; 174) |
|
Т, сек
|
107,5 (90,5; 127) |
112,5 (91; 126) |
115,5 (92; 138,5) |
56,0 р1-3 (45;75,5) |
54,0 р1-3 (45,5; 66,5) |
88,5 (84,5; 95,5) |
|
Vc, усл.ед.
|
1,65 (1,45; 1,8) |
1,65 (1,4; 1,73) |
1,15 р1,2, *р (1,1; 1,25) |
1,58 р3 (1,45; 1,68) |
1,25 (1,15; 1,45) |
0,93 р1-3 (0,75; 1,05) |
|
Т3, сек
|
8,55*р (7,7; 10,5) |
10,88 (8,73; 12,25) |
8,15 (7,15; 9,95) |
9,60 (8,98; 10,9) |
12,75 р1,3 (11,65; 14,6) |
9,60 (8,75; 10,95) |
|
Введение ФК в течение 21 суток после ЭОТ |
||||||
|
серии |
БР-Э |
БР-РС |
||||
|
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
|
сутки |
1 |
7 |
21 |
1 |
7 |
21 |
|
Т1, сек
|
58,0 р2,3 (49,5; 68,5) |
65,5 (47; 80) |
72,0 (67; 85,5) |
64,5 р2 (47,5; 70,5) |
75,0 р3 (68,5; 83,5) |
84,5 (71,5; 91,5) |
|
Т2, сек
|
139,0 р3 (117,5; 163) |
135,0 р1-3 (112; 149,5) |
171,5 р3 (166,5; 177,5) |
142,0 р2-4 (136; 170,5) |
175,0 р5 (166,5; 191,5) |
184,5 (171; 196,5) |
|
Т, сек
|
87,0 (55,5; 96,5) |
59,0 (32,5; 102,5) |
102,5 (88; 108,5) |
82,5 р4 (71,5; 112) |
101,0 (91,5; 107) |
104,5 (97,5; 110,5) |
|
Vc, усл.ед.
|
1,48 (1,35; 1,55) |
1,68 р3 (1,55; 1,9) |
1,55 р3,6 (1,45; 1,75) |
1,50 р1,3 (1,4; 1,55) |
1,60 р3 (1,5; 1,6) |
1,25 р2,6 (1,15; 1,35) |
|
Т3, сек
|
8,92 (8,5; 10,15) |
14,25 р1 (12; 15,75) |
11,45 р3 (10,5; 12,85) |
8,55 р1 (7,75; 10) |
11,95 р1,3 (10,75; 13,1) |
9,90 (9,5; 10,9) |
Примечание: см. табл.1, *р - достоверность между сезонами по критерию Уилкоксона
Скорость свертывания (Vc) зимой в 1-е сутки повышается к контролю 1, в течение 7-21-х суток остается ниже нормы, но в пределах доверительного интервала контроля. Лечебный прием приводит к снижению показателя, компенсируя явление гиперкоагуляции в динамике ожоговой травмы. Летом на фоне более узкого доверительного интервала сезонного контроля (в 2 раза в сравнении с зимним сезоном) с 7-х до 21-х суток ожога отмечается тенденция к снижению скорости свертывания на 43,6% к контролю 1 (зимой - 11,7%), что говорит о более выраженном истощении свертывающего потенциала крови на фоне ожоговой травмы. Лечебный прием ФК «Биоритм-Э» и «Биоритм-РС» оказывает выраженный нормализующий эффект (р<0,05 на 7-21 сутки ожога).
Активность фибринолитической системы (по показателю времени начала фибринолиза - Т3) в зимний сезон года при ожоговой травме определяется только к 21-м суткам эксперимента. Лечебный прием приводит к активации фибринолиза уже на 7-е сутки, к 21-м отмечается тенденция к укорочению показателя. Летом в динамике ЭОТ активность фибринолитической системы сохранена, максимальное угнетение отмечено на 7-е сутки эксперимента (р=0,013).
При сравнении сезонных эффектов фитококтейлей на систему свертывания (по показателям Т1 ,Т2, Т) необходимо отметить, что разброс показателей в летний сезон года более чем в 3,5 раза шире, чем зимой, и в зимний сезон лечебные эффекты развиваются уже на 7-е сутки, тогда как в летний сезон - только к 21-м для обоих фитококтейлей, эффекты фитоадаптогенов статистически более значимы зимой. Скорость свертывания на фоне использования комплексных фитоадаптогенов в оба сезона понижается, однако степень истощения ее резервов при коагулопатии потребления ДВС-синдрома более выражена летом.
Обсуждение результатов
Для понимания характера сезонной динамики показателей у интактных крыс и у крыс с фоновым приемом фитоадаптогенов (серии 2-3) мы провели корреляционный анализ, который позволил объяснить некоторые межблоковые взаимодействия. В зимний сезон на фоне обоих ФК происходит ускорение АЧТВ, ТВ, повышение активности АТ III, присутствует тенденция к снижению фибриногена. Летом идет торможение внутреннего пути коагуляции, особенно при приеме ФК БР-РС, удлиняется ТВ, концентрация АТ III статистически значимо выше, чем зимой, активность фибринолиза также повышена. Активность и количество тромбоцитов при приеме комплексных фитоадаптогенов достоверно не изменены, отмечается тенденция к снижению скорости агрегации и удлинению времени образования сгустка, поэтому можно говорить о тенденции к гипоагрегации.
Результаты корреляционного анализа показали, что у интактных животных зимой в регуляции свертывания цельной крови принимают участие все блоки системы гемостаза и микрогемодинамика (рис.1А); летом в регулировании свертывания основная роль принадлежит преимущественно компонентам плазменного гемостаза (рис.1, Б), который обратно зависим от микроциркуляторных показателей.
На фоне фитококтейля БР-Э происходит: зимой идет усиление влияния клеточного звена гемостаза, летом, наоборот, отмечено превалирование плазменной регуляции (по внутреннему пути) на гемостаз (рис.2, А-Б). Фитококтейль БР-РС повышает силу корреляций: зимой - отдавая ведущую роль компонентам плазмы и тромбоцитам (за счет компонентов внешнего пути свертывания), летом преобладает регуляция по конечному субстрату - фибриногену и его активатору - тромбину (рис.3, А-Б).
Рис. 1. Характер межблоковых корреляций в зимний (А) и летний (Б) сезон у интактных животных по результатам анализа Спирмена (р<0,05)
положительные отрицательные связи
Рис. 2. Характер межблоковых корреляций в зимний (А) и летний (Б) сезон на фоне курсового приема фитококтейля «Биоритм-Э» по результатам анализа Спирмена (р<0,05)
положительные отрицательные связи
Рис. 3. Характер межблоковых корреляций в зимний (А) и летний (Б) сезон на фоне курсового приема фитококтейля «Биоритм-РС» по результатам анализа Спирмена (р<0,05)
положительные отрицательные связи
Сравнительный анализ источников информации убеждает, что при отсутствии стресса в эксперименте и клинике отмечаются нормализующие эффекты адаптогенов, хотя и выраженные в меньшей степени, чем при патологии [10]: наблюдается стимуляция обмена липидов, синтеза нуклеиновых кислот, снижение расходования АТФ и гликогена в мышцах, оптимизация синтеза аминокислот и их транспорта извне. По мнению ряда авторов, изменение регуляции при помощи адаптогенов, особенно таких мощных как элеутерококк и золотой корень (родиола), реализуется благодаря их действию на ЦНС, при котором уровень повышения в крови b-эдорфинов (в 4 раза) прямо коррелировал с их зашитными свойствами, проявляясь на всех уровнях регуляторных систем организма, и периферическом, вызывая развитие определенных адаптационных реакций, которые повышают функции защитных систем [2]. В наших работах комплексные фитоадаптогены демонстрируют у интактных животных изменение характера корреляций в зависимости от сезона года. В стрессовой ситуации (ожоговая травма) прием фитококтейлей снижал степень гиперкоагуляции и микроциркуляторных нарушений. Большую эффективность в оба сезона продемонстрировал фитококтейль «Биоритм-РС» содержавший родиолу розовую. Родиола розовая, как и элеутерококк, относится к группе наиболее мощных адаптогенов, и можно говорить, что комплексном фитококтейле «Биоритм-РС» на фоне выбранной композиции природных веществ ее защитные свойства более выражены.
Заключение
Таким образом, у интактных животных фитококтейли вызывали гипокоагулирующий эффект, ярче выраженный зимой. Лечебный прием комплексных фитоадаптогенов также эффективен зимой и способствует восстановлению взаимоотношений между звеньями систем гемостаза и микроциркуляции, одновременно улучшая микроциркуляцию (особенно ФК «Биоритм-Э»). Более выражены положительные эффекты в оба сезона у ФК «Биоритм-РС», содержащего большую часть родиолы розовой и девясил. Разработанные фитокомплексы «Биоритм-Э» и «Биоритм-РС» могут быть рекомендованы в качестве средств профилактики нарушений микроциркуляции, а также в комплексной терапии нарушений системы гемостаза в реабилитационном периоде ожоговой травмы.
Рецензенты:
Джиоев И.Г., д.м.н., профессор, зав. центральной научно-исследовательской лаборатории СОГМА, профессор кафедры нормальной физиологии ГБОУ ВПО Северо-Осетинская государственная медицинская академия, МЗ РФ, г. Владикавказ;
Дзугкоева Ф.С., д.м.н., профессор, зам. директора по НИР Института биомедицинских исследований ВНЦ РАН и РСО-А, г. Владикавказ.