Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,931

CONTINUOUS CULTIVATION OF STRAINS WITH REDUCED PHOTOSYNTHETIC APPARATUS OF PURPLE BACTERIA RHODOBACTER SPHAEROIDES

Eltsova Z.A. 1
1 Institute of Basic Biological Problems RAS
Проведено непрерывное культивирование штаммов с редуцированным фотосинтетическим аппаратом, а также штаммов дикого типа пурпурной несерной бактерии Rhodobacter sphaeroides. Показано, что штамм DBCΩ, лишенный периферической светособирающей антенны, способен к стабильному росту в режиме хемостата и турбидостата, в отличие от аналогичного, ранее изученного штамма, pRK puf DD13. Штамм DBCΩ рос в условиях турбидостата со скоростью 0,1 час-1, при этом 14 Вт/м2 являлась насыщающей интенсивностью света. Концентрация бактериохлорофилла а в клетках как мутантного штамма, так и штамма дикого типа, падала при увеличении интенсивности света. Таким образом, штамм DBCΩ с редуцированным фотосинтетическим аппаратом может быть использован для дальнейших биотехнологических исследований.
Mutants with reduced photosynthetic apparatus and wild type mutant of purple nonsulfur bacteria Rhodobacter sphaeroides was grown in the continuous culture in photobioreactor. It was shown, the DBCΩ strain without peripheral antenna complex are able to grow very stable during a long time under flowing coindition, unlike another strain with reduced photosynthetic apparatus, pRK puf DD13. The grow rate of DBCΩ was 0,1 h-1. Saturated light intensity for this strain was 14 W/m2. Total concentration of bacteriochlorophyll a decreased with increasing of light intensity for both strains, wild type strain and DBCΩ. During the experiments has been found that DBCΩ strain is suitable for biotechnological application, for biohydrogen production, for example.
continuous cultivation
reduced photosynthetic apparatus
bacteria

Введение

Пурпурные бактерии являются ценными объектами биотехнологии, так как они обладают высокой скоростью роста и способны к деградации широкого спектра отходов различных производств [3]. Предполагается, что штаммы пурпурных бактерий с пониженным синтезом пигментов могут быть перспективными для получения водорода, в частности, в условиях лимитирования светом [4]. Однако не все мутантные штаммы способны к устойчивому росту. В нашей предыдущей работе показано, что штамм Rhodobacter sphaeroides pRK puf DD13, не имеющий периферийного светособирающего антенного комплекса, отличается низкой скоростью роста (0,02 ч-1) и нестабильностью при непрерывном фотогетеротрофном культивировании [1]. Целью представленных исследований было выяснить особенности непрерывного культивирования другого штамма Rba. sphaeroides DBCΩ с редуцированной периферической светособирающей антенной [2].

Материал и методы

Штамм Rba. sphaeroides DBCΩ характеризуется нарушенной сборкой пигмент-белкового комплекса периферической светособирающей антенны (LH2), так как в puc-оперон, ответственный за синтез белков периферической светособирающей антенны, вставлена кассета устойчивости к антибиотику стрептомицину, что делает невозможной нормальную экспрессию белков периферического светособирающего комплекса. Родительским для этого мутантного штамма является штамм Rba. sphaeroides 2.4.1 ATCC [2], который использовался нами в качестве контрольного. Штаммы были любезно предоставлены лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии университета г. Шеффилд (Великобритания). Рекомбинантные штаммы с модифицированным фотосинтетическим аппаратом pRK puf DD13 и pRK puf ΔLM1, также использованные в этой работе, подробно описаны ранее [1].

Культивирование инокулята осуществлялось в стеклянных сосудах объемом 250 мл. Для инокулята использовалась среда Ормеруда с добавлением молочной кислоты 30 мМ, а также дрожжевого экстракта 1,0 гл, начальный рН 6,8-7,0. Культивирование проводили фотогетеротрофно анаэробно при 28°С в присутствии антибиотиков (мкгмл): для штамма pRK puf ΔLM1 – тетрациклин (5), канамицин (30); для штамма pRK puf DD13 – тетрациклин (1), канамицин (5) и стрептомицин (5); для штамма DBCΩ – стрептомицин (5). В некоторых экспериментах штаммы культивировали без антибиотиков, когда селективным маркером, препятствующим элиминации плазмид из клетки, являлась способность к фотогетеротрофному росту.

Непрерывное культивирование штаммов DBCΩ и 2.4.1 осуществляли на свету в фотобиореакторе (ФБР) на основе коаксиальных цилиндров [5] в режиме хемостата с лимитированием аммонием (2-4 мМ NH4+, скорость протока 0,02 ч–1, рН 7,0). Культивирование проводили на среде Ормеруда с 50 мМ молочной кислотой и дрожжевым экстрактом (0,1 гл). Для обеспечения анаэробных условий в реактор непрерывно подавали аргон (20,0 млмин). После посева инокулята в ФБР осуществлялось периодическое культивирование в течение 24 ч с поддержанием рН 7,0, затем включался режим хемостат. В результате разбавления оптическая плотность культуры начинала падать до тех пор, пока культура не достигала состояния динамического равновесия, при котором скорость роста равна скорости протока. Непрерывное культивирование в режиме турбидостата проводилось при заданной оптической плотности (ОП) 0,2 для обоих штаммов на среде Ормеруда. В каждом режиме для обеспечения анаэробных условий в реактор непрерывно подавали аргон (20 млмин). Рабочий объем составлял 0,75 л.

Количество бактериохлорофилла а (БХл а) в клетках определяли спектрофотометрически (спектрофотометр Shimadzu, Япония) при λ=772 нм в ацетон-метанольном экстракте [1].

Определение абсолютно сухого веса (АСВ) клеток проводили, как описано ранее [1].

Определение оптической плотности суспензии проводилось датчиком в ФБР (длина оптического пути 3 мм), а также спектрофотометрически (спектрофотометр Shimadzu, Япония) при λ=650 нм и длине оптического пути 1 мм.

3. Результаты исследования и их обсуждение

Исследования показали, что при культивировании в ФБР в режиме хемостат при скорости протока 0,02 ч-1 штамм Rba. sphaeroides DBCΩ через 8-12 дней выходит в состояние динамического равновесия, которое характеризуется постоянной концентрацией БХл а и клеток (АСВ и оптическая плотность культуры не изменяются) (Рис. 1). В отличие от ранее изученного штамма Rba. sphaeroides pRK puf DD13, штамм DBCΩ имел устойчивый рост, что позволило далее провести исследования в режиме турбидостата.

Рис. 1. Культивирование штамма Rba. sphaeroides DBCΩ в режиме хемостат с лимитированием аммонием (4 мМ NH4+) при скорости протока 0,02 ч-1.

Культивирование в режиме турбидостат при заданной ОП=0,2 (АСВ=0,55 г/л) показало, что скорость роста возрастала до 0,1 ч-1 с увеличением интенсивности света от 8 до 14 Вт/м2, не изменяясь при дальнейшем увеличении интенсивности (рис. 2). При этом снижалось содержание БХл а, как абсолютное, так и относительное (БХлАСВ). Максимальное относительное содержание составило 2,3 мг/г при 14 Вт/м2. При высоких интенсивностях света относительное содержание БХл а снижалось до 1,3 мг/г.

Рис. 2. Зависимость скорости роста (D), содержания БХл а и АСВ от интенсивности падающего света для штамма Rba. sphaeroides DBCΩ в режиме турбидостат.

Для сравнения были проведены аналогичные эксперименты с родительским штаммом Rba. sphaeroides 2.4.1. В режиме хемостат (при скорости протока 0,02 ч-1) культура также характеризовалась стабильным ростом. В режиме турбидостат при ОП=0,2 (АСВ=0,43 г/л) скорость роста возрастала до 0,2 ч-1 с увеличением интенсивности света от 4 до 32 Вт/м2 (рис. 3).

Рис. 3. Зависимость скорости роста (D),  содержания БХл а и АСВ у штамма Rba. sphaeroides 2.4.1 от интенсивности падающего света в режиме турбидостат.

Относительное содержание Бхл а при этом снижалось. Однако максимальная величина этого показателя была гораздо выше (16,2 мгг) по сравнению с мутантным штаммом при низкой интенсивности, и эта величина уменьшалась до 4 мг/г при высокой интенсивности. Таким образом, штамм с нарушенным синтезом антенны имел более низкое содержание Бхл а в расчете на сухой вес, как при высоких, так и при низких интенсивностях света, а также более низкую скорость роста, чем родительский штамм, в условиях турбидостата. У описанного ранее рекомбинантного штамма с модифицированным фотосинтетическим аппаратом Rba. sphaeroides pRK puf DD13 влияние интенсивности света (в области высоких значений) на содержание БХл а изучали в режиме хемостат при разных концентрациях аммония. Как видно из Табл. 1, и абсолютное, и относительное содержание Бхл а уменьшалось с увеличением интенсивности падающего света, независимо от концентрации аммония. Однако при одной и той же интенсивности падающего света относительное содержание БХл а было выше при меньшей концентрации клеток (2 мМ NH4+), хотя средняя интенсивность света в ФБР, в этом случае должна быть выше.

Таблица 1. Влияние интенсивности света на содержание БХл  у штамма Rba. sphaeroides pRK puf DD13 при росте в режиме хемостат с лимитированием аммонием. Концентрация АСВ была 0,47±0,005 и 1,05±0,07 г/л при 2 и 4 мМ аммония соответственно.

Интенсивность света, Вт/м2

Содержание БХл, мг/л

Относительное содержание БХл, мг/г АСВ

2 мМ NH4

4 мМ NH4

2 мМ NH4

4 мМ NH4

41,0

1,66±0,09

1,84±0,19

3,50

1,8

61,0

1,38±0,07

2,04±0,03

2,95

1,9

84,5

0,67±0,09

1,41±0,03

1,40

1,3

Для сравнения данные по изученным штаммам Rba. sphaeroides с нарушенным синтезом пигментов при выращивании в режиме хемостат представлены в табл. 2.

Таблица 2. Содержание АСВ, БХл, БХл/АСВ и экономический коэффициент использования аммония  (Yамм) для некоторых штаммов Rba. sphaeroides при росте в хемостате (0,02 ч-1) с лимитированием аммонием (интенсивность света 25-41 Вт/м2).

 

Штамм

 

NH4, мМ

 

БХл, мг/л

 

АСВ, г/л

БХл/АСВ,

мг/г

 

Yамм, г/моль

DBCΩ

4

1,94

0,85

2,28

212

2.4.1

2

1,88

0,43

4,40

215

pRK puf DD13

2

1,66

0,45

3,69

225

4

1,84

1,05

1,75

263

pRK puf ΔLM1

2

6,14

0,31

19,8

155

Как в случае DBCΩ, так и в случае pRK puf DD13 относительное содержание Бхл a было выше у родительских штаммов (соответственно, 2.4.1 и pRK puf ΔLM1) по сравнению с мутантными. На основании величин АСВ был рассчитан экономический коэффициент использования аммония в режиме хемостат. Между мутантом DBCΩ и родительским штаммом 2.4.1  достоверных различий обнаружено не было. Таким образом, нарушение синтеза пигментов не сказалось на азотном обмене бактерий. У родительского штамма pRK puf ΔLM1 обнаружен пониженный экономический коэффициент использования аммония и аномально высокие значения концентрации БХл а, что может косвенно указывать на компенсаторные механизмы, включающиеся при разобщении фотосинтетического аппарата, так как у этого штамма гены, кодирующие синтез реакционного центра и коровой светособирающей антенны, находятся на плазмиде.

Заключение

Как показывают приведенные нами исследования, штамм DBCΩ с редуцированным фотосинтетическим аппаратом способен к устойчивому росту при непрерывном культивировании, в отличие от ранее исследованного штамма pRK puf DD13. Зависимость скорости роста от интенсивности света носит сходный характер у штамма DBCΩ и дикого типа 2.4.1, хотя скорость роста у последнего выше в 2 раза.

У штаммов с редуцированным фотосинтетическим аппаратом (DBCΩ и pRK puf DD13) накопление пигментов снижается с увеличением интенсивности света, что сходно с родительскими штаммами. При этом максимальное относительное содержание БХл а достигало 20 мг/г у родительского штамма pRK puf ΔLM1.

Полученные данные позволяют рекомендовать штамм Rba. sphaeroides DBCΩ для дальнейших исследований с использованием непрерывного культивирования с целью получения водорода, а штамм pRK puf ΔLM1 – в качестве продуцента БХл.

Рецензенты:

Гудков С.В., д.б.н., ведущий научный сотрудник, Федеральное бюджетное учреждение науки Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино.

Белова Н.А., д.б.н., ведущий научный сотрудник, Федеральное бюджетное учреждение науки Институт Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино.