Scientific journal
Modern problems of science and education
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

DETERMINATION METHOD CHLOROGENIC ACID PLANAR CHROMATOGRAPHY

Ovchinnikova S.Ya. 1 Mezenova T.D. 1 Orlovskaya T.V. 2
1 Pyatigorsk branch GBOU VPO «Volgograd State Medical University», Ministry of Health of Russia
2 The North Caucasus Federal University, Pyatigorsk, Russia
Разработана и валидирована методика идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в корневищах и корнях любистка лекарственного (Levísticum officinále Koch.) методом ТСХ с видеоденситометрической регистрацией аналитического сигнала. Цифровую обработку хроматограмм осуществляли с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар). Извлечение получали методом реперколяции этиловым спиртом 70%. Для хроматографирования использовали пластинки марки «Sorbfil» ПТСХ-П-В-УФ (г.Краснодар), подвижная фаза: n-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (5:4:1). Детектирующий реагент – пары аммиака. Хлорогеновая кислота проявляется в виде пятен тёмно-коричневого цвета с Rf 0,54±0,02. Предел обнаружения 0,5 мкг/мкл. Установлены параметры линейности, правильности и сходимости разработанной методики. Методика определения хлорогеновой кислоты специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность.
Developed and validated method of identification and quantitative determination of chlorogenic acid in the rhizomes and roots of Lovage (Levísticum officinále Koch.) TLC videodensitometricheskoy registration with the analytical signal. Digital processing of the chromatograms was performed using the computer program «video densitometry Sorbfil» ( Krasnodar). Extract repercolation yeild 70% ethyl alcohol. Chromatography was used for the stamp plate «Sorbfil» PTLC -P -V- UV (Krasnodar), mobile phase: n- butanol - glacial acetic acid - water (5:4:1). Detection reagent - ammonia vapors. Chlorogenic acid is manifested in the form of spots of dark brown color with Rf 0,54 ± 0,02. Detection limit of 0.5 ug / ml. The parameters of linearity, accuracy and convergence of the developed technique. Methods of determining specific chlorogenic acid, has a high sensitivity and efficiency.
validation
quantification
identification
TLC
rhizomes and roots
Levísticum officinále
chlorogenic acid

Введение. Хлорогеновая кислота обладает широким спектром биологической активности. Доказано ее действие в качестве антибактериального, противовирусного, противовоспалительного, гепатопротекторного, антимутагенного, гипотензивного биологически активного вещества. Установлены ее пребиотические свойства [4, 5]. Хлорогеновая кислота и ее производные, оказывают более сильный антиоксидантный эффект, чем аскорбиновая кислота, кофейная кислота и токоферол (витамин Е), может эффективно удалить ДФПГ радикал, гидроксильный радикал и супероксид анион радикалы, подавлять липопротеины низкой плотности окисления [2].

В ходе фитохимичеcкого изучения методом ВЭЖХ было установлено наличие хлорогеновой кислоты в корневищах и корнях любистка лекарственного (Levísticum officinále Koch.) семейства сельдерейных (Apiaceae).

Согласно требованиям, предъявляемым к современным методам стандартизации ЛРС необходимо разрабатывать показатели норм качества в зависимости от пути его использования при производстве лекарственных средств [3]. Исходя из первичного аналитического скрининга, фенолкарбоновые кислоты являются доминирующими и на их долю приходится основной вклад ожидаемого фармакологического эффекта, поэтому и разрабатывали методики их качественного и количественного определения.

Цель работы. Разработка методики идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в корнях и корневищах любистка лекарственного.

Материал и методика. Сырьём для анализа являлись высушенные корневища и корни, заготовленные от растений культивируемых в условиях Кавказских Минеральных Вод в период 2010-2011 гг. В качестве экстрагента использовали 70% спирт этиловый в соотношении 1:2. Извлечение получали методом реперколяции (повторная или многократная перколяция). Сущность метода заключалась в том, что сырье делили на части и каждую последующую его порцию экстрагировали вытяжкой, полученной из предыдущей.

Для приготовления стандартного образца (СО) 0,1 г хлорогеновой кислоты (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, растворяли в этиловом спирте 95% и доводили спиртом раствор до метки. Концентрация СО хлорогеновой кислоты составила 1,0 мкг/мкл.

Для идентификации и количественного определения использовали метод ТСХ с последующей денситометрической обработкой хроматограмм. Хроматографирование проводили на пластинках марки «Sorbfil» (г. Краснодар) размером 10х15 см. В качестве подвижной фазы использовали систему n-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (5:4:1). Высота подъема растворителя 9 см. Детектирование проводили парами аммиака.

На линию старта хроматографической пластинки длиной 15 см наносили 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкл раствора СО с содержанием хлорогеновой кислоты 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкг соответственно. На этой же пластинке обозначали четыре линии контрольных треков, на которые наносили спиртовое извлечение объемом 20 мкл. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10 (агат). Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. Через 10-15 минут на воздухе появляются пятна тёмно-коричневого цвета. Для усиления окраски пластинку держали над парами аммиака концентрированного.

Далее пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» (разрешение 100 dpi) и осуществляли их цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil v1.7» (г. Краснодар). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта), по градуировочному графику зависимости «масса вещества – площадь пика» (линейная аппроксимация).

Результаты и их обсуждение. Определение хроматографических характеристик. Для выбора наиболее эффективных пластинок исследовали пластинки следующих марок: ПТСХ-П-В-УФ, ПТСХ-П-А-УФ и ПТСХ-АФ-В-УФ (г. Краснодар). Эффективность пластинки определяли по числу теоретических тарелок (NTR) и ассиметрии (As) пятен стандартных образцов.

Таблица 1 – Показатели эффективности различных типов пластинок

Тип пластики

NTR

As

ПТСХ-П-В-УФ

1308±250

0,67±0,09

ПТСХ-П-А-УФ

694±185

0,48±0,03

ПТСХ-АФ-В-УФ

604±121

0,39±0,03

Наиболее эффективными являются пластинки марки ПТСХ-П-В-УФ, которые были выбраны нами для определения хлорогеновой кислоты в спиртовом извлечении (табл. 1).

Чувствительность детектирующего реагента устанавливали по величине предела обнаружения (ПО), нанося точно известное количество СО хлорогеновой кислоты на хроматографическую пластинку. Готовили растворы стандартного образца с концентрациями 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0 и далее – до 3-х мкг/мкл. На пластинку наносили по 1 мкл приготовленных растворов и хроматографировали. ПО составляет 0,5 мкг/мкл.

Специфичность определяли по величине Rf пятна контрольного трека, которое должно соответствовать Rf пятен стандартного образца (0,56±0,02). На треках контрольного образца визуально обнаруживалось пятно тёмно-коричневого цвета с Rf 0,54, что соответствует окраске и Rf стандартных образцов (рис 1.).

Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» [1].

Валидация методики количественного анализа проведена по следующим критериям: линейность, правильность и сходимость результатов.

Рисунок 1 – Оцифрованная хроматограмма СО хлорогеновой кислоты и спиртового извлечения:

1 – 1 мкг/мкл; 2 – 1,5 мкг/мкл; 3 – 2 мкг/мкл; 4 – 2,5 мкг/мкл; 5 – 3 мкг/мкл; 6 – спиртовое извлечение

Линейность устанавливали по градуировочным графикам, полученным при компьютерной обработке хроматограмм в координатах площадь пика (S) – масса (m, мкг). Диапазон концентраций хлорогеновой кислоты 1,0-3,0 мкг/мкл. По данным градуировочных графиков рассчитывали статистические характеристики и коэффициент корреляции. Методом наименьших квадратов определяли значимость свободного члена линейной зависимости (а), углового коэффициента (b). Расчеты проводили с помощью программы Microsoft Excel. Градуировочный график по данным одной из пластин описывается уравнением y = (10,7х - 7,3)103, коэффициент корреляции r = 0,984 (рис. 2).

Рисунок 2 – Градуировочный график хлорогеновой кислоты

Правильность методики определяли методом «введено-найдено». По уравнению градуировочного графика рассчитывали содержание хлорогеновой кислоты на 5-и уровнях концентраций СО и рассчитывали метрологические характеристики (табл. 2).

Таблица 2 – Результаты определения открываемости хроматографической методики

Уровень

Взято, мкг

Найдено, мкг

Открываемость, %

Метрологические характеристики

1

1,0

1,06

106

Хср = 100,7

DХ = 6,13

SD = 8,57

RSD% = 8,5%

Е% =6,1%

1

1,0

1,06

106

2

1,5

1.37

91

2

1,5

1,47

98

3

2,0

2,14

107

3

2,0

2,02

101

4

2,5

2,22

89

4

2,5

2,35

93

5

3,0

3,5

117

5

3,0

2,97

99

Сходимость методики оценивали по результатам повторного определения содержания хлорогеновой кислоты в растительном сырье (табл. 3).

Таблица 3 – Экспериментальные данные определения хлорогеновой кислоты

Результат расчета концентрации

Номер трека

Стандарт/Проба

Количество

Rf

1

Стандарт

1,08 мкг

0,56

2

Стандарт

1,62 мкг

0,58

3

Проба

3900 мг/кг

0,55

4

Стандарт

2,16 мкг

0,57

5

Проба

3400 мг/кг

0,56

6

Стандарт

2,7 мкг

0,58

7

Проба

3700 мг/кг

0,55

8

Стандарт

3,24 мкг

0,56

9

Проба

3900 мг/кг

0,53

Выводы. В результате проведённых исследований разработана методика идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в растительном сырье методом планарной хроматографии на пластинках марки ПТСХ-П-В-УФ (г. Краснодар). Полученные данные свидетельствуют, что методика специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Методика количественного определения отвечает необходимым требованиям по показателям линейность, правильность и сходимость.

Содержание хлорогеновой кислоты в корнях и корневищах любистка лекарственного, определённое данной методикой, составило 0,37% в пересчёте на воздушно сухое сырьё.

Рецензенты:

Компанцев В.А., д.ф.н., профессор кафедры неорганической химии Пятигорского медико-фармацевтический института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г.Пятигорск.

Кодониди И.П., д.ф.н., доцент кафедры органической химии Пятигорского медико-фармацевтический института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г.Пятигорск.