Электронный научный журнал
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,737

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРОГЕНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Овчинникова С.Я. 1 Мезенова Т.Д. 1 Орловская Т.В. 2
1 Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России
2 Северо-кавказский федеральный университет
Разработана и валидирована методика идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в корневищах и корнях любистка лекарственного (Levísticum officinále Koch.) методом ТСХ с видеоденситометрической регистрацией аналитического сигнала. Цифровую обработку хроматограмм осуществляли с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil» (г. Краснодар). Извлечение получали методом реперколяции этиловым спиртом 70%. Для хроматографирования использовали пластинки марки «Sorbfil» ПТСХ-П-В-УФ (г.Краснодар), подвижная фаза: n-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (5:4:1). Детектирующий реагент – пары аммиака. Хлорогеновая кислота проявляется в виде пятен тёмно-коричневого цвета с Rf 0,54±0,02. Предел обнаружения 0,5 мкг/мкл. Установлены параметры линейности, правильности и сходимости разработанной методики. Методика определения хлорогеновой кислоты специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность.
валидация
количественное определение
идентификация
ТСХ
корневища и корни
любисток лекарственный
хлорогеновая кислота
1. Государственная фармакопея СССР: Общие методы анализа. Лекарственное сырье. 11-изд. доп. М.: Медицина,1990. С. 400.
2. Левицкий А.П., Вертикова Е.К., Селиванская И.А. Хлорогеновая кислота: биохимия и физиология // Мікробіологія і біотехнологія. 2010. № 2. С. 6-20.
3. Самылина И.А., Баландина И.А. Пути использования лекарственного растительного сырья и его стандартизация // Фармация. 2004. № 2. С. 39-41.
4. Тутельян В.А., Лашнева Н.В. Биологически активные вещества растительного происхождения. Фенольные кислоты: распространенность, пищевые источники, биодоступность // Вопросы питания. 2008. Т. 77, №1. С. 4-19.
5. Antihypertensive effects and mechanisms of chlorogenic acids / Zhao Y. et al. // Hypertens Rec. 2012. Vol. 35, № 4. Р. 370-374.

Введение. Хлорогеновая кислота обладает широким спектром биологической активности. Доказано ее действие в качестве антибактериального, противовирусного, противовоспалительного, гепатопротекторного, антимутагенного, гипотензивного биологически активного вещества. Установлены ее пребиотические свойства [4, 5]. Хлорогеновая кислота и ее производные, оказывают более сильный антиоксидантный эффект, чем аскорбиновая кислота, кофейная кислота и токоферол (витамин Е), может эффективно удалить ДФПГ радикал, гидроксильный радикал и супероксид анион радикалы, подавлять липопротеины низкой плотности окисления [2].

В ходе фитохимичеcкого изучения методом ВЭЖХ было установлено наличие хлорогеновой кислоты в корневищах и корнях любистка лекарственного (Levísticum officinále Koch.) семейства сельдерейных (Apiaceae).

Согласно требованиям, предъявляемым к современным методам стандартизации ЛРС необходимо разрабатывать показатели норм качества в зависимости от пути его использования при производстве лекарственных средств [3]. Исходя из первичного аналитического скрининга, фенолкарбоновые кислоты являются доминирующими и на их долю приходится основной вклад ожидаемого фармакологического эффекта, поэтому и разрабатывали методики их качественного и количественного определения.

Цель работы. Разработка методики идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в корнях и корневищах любистка лекарственного.

Материал и методика. Сырьём для анализа являлись высушенные корневища и корни, заготовленные от растений культивируемых в условиях Кавказских Минеральных Вод в период 2010-2011 гг. В качестве экстрагента использовали 70% спирт этиловый в соотношении 1:2. Извлечение получали методом реперколяции (повторная или многократная перколяция). Сущность метода заключалась в том, что сырье делили на части и каждую последующую его порцию экстрагировали вытяжкой, полученной из предыдущей.

Для приготовления стандартного образца (СО) 0,1 г хлорогеновой кислоты (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, растворяли в этиловом спирте 95% и доводили спиртом раствор до метки. Концентрация СО хлорогеновой кислоты составила 1,0 мкг/мкл.

Для идентификации и количественного определения использовали метод ТСХ с последующей денситометрической обработкой хроматограмм. Хроматографирование проводили на пластинках марки «Sorbfil» (г. Краснодар) размером 10х15 см. В качестве подвижной фазы использовали систему n-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (5:4:1). Высота подъема растворителя 9 см. Детектирование проводили парами аммиака.

На линию старта хроматографической пластинки длиной 15 см наносили 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкл раствора СО с содержанием хлорогеновой кислоты 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мкг соответственно. На этой же пластинке обозначали четыре линии контрольных треков, на которые наносили спиртовое извлечение объемом 20 мкл. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10 (агат). Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. Через 10-15 минут на воздухе появляются пятна тёмно-коричневого цвета. Для усиления окраски пластинку держали над парами аммиака концентрированного.

Далее пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» (разрешение 100 dpi) и осуществляли их цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfil v1.7» (г. Краснодар). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта), по градуировочному графику зависимости «масса вещества – площадь пика» (линейная аппроксимация).

Результаты и их обсуждение. Определение хроматографических характеристик. Для выбора наиболее эффективных пластинок исследовали пластинки следующих марок: ПТСХ-П-В-УФ, ПТСХ-П-А-УФ и ПТСХ-АФ-В-УФ (г. Краснодар). Эффективность пластинки определяли по числу теоретических тарелок (NTR) и ассиметрии (As) пятен стандартных образцов.

Таблица 1 – Показатели эффективности различных типов пластинок

Тип пластики

NTR

As

ПТСХ-П-В-УФ

1308±250

0,67±0,09

ПТСХ-П-А-УФ

694±185

0,48±0,03

ПТСХ-АФ-В-УФ

604±121

0,39±0,03

Наиболее эффективными являются пластинки марки ПТСХ-П-В-УФ, которые были выбраны нами для определения хлорогеновой кислоты в спиртовом извлечении (табл. 1).

Чувствительность детектирующего реагента устанавливали по величине предела обнаружения (ПО), нанося точно известное количество СО хлорогеновой кислоты на хроматографическую пластинку. Готовили растворы стандартного образца с концентрациями 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0 и далее – до 3-х мкг/мкл. На пластинку наносили по 1 мкл приготовленных растворов и хроматографировали. ПО составляет 0,5 мкг/мкл.

Специфичность определяли по величине Rf пятна контрольного трека, которое должно соответствовать Rf пятен стандартного образца (0,56±0,02). На треках контрольного образца визуально обнаруживалось пятно тёмно-коричневого цвета с Rf 0,54, что соответствует окраске и Rf стандартных образцов (рис 1.).

Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» [1].

Валидация методики количественного анализа проведена по следующим критериям: линейность, правильность и сходимость результатов.

Рисунок 1 – Оцифрованная хроматограмма СО хлорогеновой кислоты и спиртового извлечения:

1 – 1 мкг/мкл; 2 – 1,5 мкг/мкл; 3 – 2 мкг/мкл; 4 – 2,5 мкг/мкл; 5 – 3 мкг/мкл; 6 – спиртовое извлечение

Линейность устанавливали по градуировочным графикам, полученным при компьютерной обработке хроматограмм в координатах площадь пика (S) – масса (m, мкг). Диапазон концентраций хлорогеновой кислоты 1,0-3,0 мкг/мкл. По данным градуировочных графиков рассчитывали статистические характеристики и коэффициент корреляции. Методом наименьших квадратов определяли значимость свободного члена линейной зависимости (а), углового коэффициента (b). Расчеты проводили с помощью программы Microsoft Excel. Градуировочный график по данным одной из пластин описывается уравнением y = (10,7х - 7,3)103, коэффициент корреляции r = 0,984 (рис. 2).

Рисунок 2 – Градуировочный график хлорогеновой кислоты

Правильность методики определяли методом «введено-найдено». По уравнению градуировочного графика рассчитывали содержание хлорогеновой кислоты на 5-и уровнях концентраций СО и рассчитывали метрологические характеристики (табл. 2).

Таблица 2 – Результаты определения открываемости хроматографической методики

Уровень

Взято, мкг

Найдено, мкг

Открываемость, %

Метрологические характеристики

1

1,0

1,06

106

Хср = 100,7

DХ = 6,13

SD = 8,57

RSD% = 8,5%

Е% =6,1%

1

1,0

1,06

106

2

1,5

1.37

91

2

1,5

1,47

98

3

2,0

2,14

107

3

2,0

2,02

101

4

2,5

2,22

89

4

2,5

2,35

93

5

3,0

3,5

117

5

3,0

2,97

99

Сходимость методики оценивали по результатам повторного определения содержания хлорогеновой кислоты в растительном сырье (табл. 3).

Таблица 3 – Экспериментальные данные определения хлорогеновой кислоты

Результат расчета концентрации

Номер трека

Стандарт/Проба

Количество

Rf

1

Стандарт

1,08 мкг

0,56

2

Стандарт

1,62 мкг

0,58

3

Проба

3900 мг/кг

0,55

4

Стандарт

2,16 мкг

0,57

5

Проба

3400 мг/кг

0,56

6

Стандарт

2,7 мкг

0,58

7

Проба

3700 мг/кг

0,55

8

Стандарт

3,24 мкг

0,56

9

Проба

3900 мг/кг

0,53

Выводы. В результате проведённых исследований разработана методика идентификации и количественного определения хлорогеновой кислоты в растительном сырье методом планарной хроматографии на пластинках марки ПТСХ-П-В-УФ (г. Краснодар). Полученные данные свидетельствуют, что методика специфична, имеет достаточно высокую чувствительность и эффективность. Методика количественного определения отвечает необходимым требованиям по показателям линейность, правильность и сходимость.

Содержание хлорогеновой кислоты в корнях и корневищах любистка лекарственного, определённое данной методикой, составило 0,37% в пересчёте на воздушно сухое сырьё.

Рецензенты:

Компанцев В.А., д.ф.н., профессор кафедры неорганической химии Пятигорского медико-фармацевтический института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г.Пятигорск.

Кодониди И.П., д.ф.н., доцент кафедры органической химии Пятигорского медико-фармацевтический института – филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России, г.Пятигорск.


Библиографическая ссылка

Овчинникова С.Я., Мезенова Т.Д., Орловская Т.В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРОГЕНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 6.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=11408 (дата обращения: 21.06.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252