Введение
На сегодняшний день известно более 500 нозологических формнаследственных болезней обмена (НБО). Основная часть НБО встречается крайне редко, но их суммарная частота в популяции составляет 1:1000-1:5000 [1-2]. Как правило, НБО манифестируютна первом году жизни неспецифическими симптомами, клинически маскирующими их под другую, ненаследственную соматическую патологию. Вместе с тем, своевременная диагностика метаболических наследственных заболеваний важна, так как для многих из них разработаны и продолжают разрабатываться эффективные методы патогенетического лечения, без которого исход заболеваний зачастую остается фатальным. Общепризнано, что одним из наиболее оправданных и эффективных подходов к раннему выявлению наследственной патологии является неонатальный генетический скрининг. Развитие метода тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с электроспрейной ионизацией [3] сделало крупномасштабный масс-спектрометрический скрининг применимым в практике массового обследования на НБО к концу 90-х годов ХХ века. Этот высокочувствительный микрометод позволяет одновременно определять в нескольких микролитрах крови концентрации десятков аминокислот и ацилкарнитинов, имеющих значение для диагностики НБО. Эффективность лабораторного теста МС/МС позволила включить его в государственные программы неонатального скрининга новорожденных детей на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального β-окисления жирных кислот в ряде стран [5, 6]. Тем не менее, в Российской Федерации метод МС/МС не внедрен в систему массового обследования новорожденных детей и доступен для селективного скрининга на НБО только в единичных федеральных медицинских центрах.
Целью данного исследования явилось научное обоснование необходимости включения в региональные программы массового обследования новорожденных детей исследований методом МС/МС для диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления жирных кислот на основе проведения ретроспективного масс-спектрометрического анализа образцов крови больных детей, заболевания которых закончились летальным исходом на первом году жизни.
Пациенты и методы исследования
В настоящее ретроспективное исследование включены дети (n=86, соотношение мальчики:девочки 48/38), умершие на первом году жизни (в возрасте от 5 суток до 11 месяцев жизни) в течение одного календарного года (2010 год) на административной территории Краснодарского края. В исследование включены дети с врожденными пороками развития (n=29), инфекционными заболеваниями - пневмония, сепсис, бактериальный менингоэнцефалит (n=37), перинатальным поражением ЦНС (n=11), синдромом внезапной смерти (n=6) и иными заболеваниями (n=3). Контрольную группу составили 438 клинически здоровых новорожденных детей (227 девочек, 211 мальчиков) в возрасте 3-8 дней. В данной группе были определены референсные значения концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в капиллярной крови у здоровых детей периода новорожденности.
Материалом для исследования послужили архивные образцы периферической крови на стандартных бумажных тест-бланках, полученные на 3-8 день жизни, для проведения стандартного неонатального скрининга. Концентрацию аминокислот и ацилкарнитинов (табл. 1) в крови определяли методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) с помощью квадрупольного тандемного масс-спектрометра Agilent 6410 (AgilentTechnologies, США) по сертифицированной методике компании CHROMSYSTEM № V1 07 05 57136 001. Исследование было выполнено в лаборатории медицинской генетики ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский институт Минздрава России».
Таблица 1
Метаболиты, определяемые методом МС/МС
№ |
Метаболит |
Условное обозначение |
№ |
Метаболит |
Услов-ное обозна-чение |
А м и н о к и с л о т ы |
|
||||
1. |
Аланин |
Ala |
21. |
3-метилкротонилкарнтин |
C5:1 |
2. |
Аспарагиноваякислота |
Asp |
22. |
3-гидроксиизовалерилкарнитин |
C5OH |
3. |
Глутаминоваякислота |
Glu |
23. |
Гексаноилкарнитин |
C6 |
4. |
Лейцин+изолейцин |
Xle |
24. |
Октаноилкарнитин |
C8 |
5. |
Метионин |
Met |
25. |
Октеноилкарнитин |
C8:1 |
6. |
Фенилаланин |
Phe |
26. |
Деканоилкарнитин |
C10 |
7. |
Тирозин |
Tyr |
27. |
Деценоилкарнитин |
C10:1 |
8. |
Валин |
Val |
28. |
Додеканоилкарнитин |
C12 |
9. |
Аргинин |
Arg |
29. |
Миристилкарнитин |
C14 |
10. |
Цитруллин |
Cit |
30. |
Тетрадеценоилкарнитин |
C14:1 |
11. |
Глицин |
Gly |
31. |
Тетрадециноилкарнитин |
C14:2 |
12. |
Орнитин |
Orn |
32. |
Гидроксимиристилкарнтин |
C14OH |
А ц и л к а р н и т и н ы |
33. |
Пальмитоилкарнитин |
С16 |
||
13. |
Свободныйкарнитин |
C0 |
34. |
Гексадеценоилкарнитин |
C16:1 |
14. |
Ацетилкарнитин |
C2 |
35. |
Гидроксигексадеценоилкарнитин |
C16:1OH |
15. |
Пропионилкарнитин |
C3 |
36. |
Гидроксипальмитоилкарнитин |
C16OH |
16. |
Малонилкарнитин |
C3DC |
37. |
Стеароилкарнитин |
C18 |
17. |
Бутирилкарнтин |
C4 |
38. |
Олеоилкарнитин |
C18:1 |
18. |
Метилмалонилкарнитин |
C4DС |
39. |
Гидроксистеароилкарнитин |
C18OH |
19. |
Изовалерилкарнтин |
C5 |
40. |
Гидроксиолеоилкарнитин |
C18:1OH |
20. |
Глутарилкарнитин |
C5DC |
41. |
Гидроксилиноилкарнитин |
C18:2OH |
Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6,0 и электронных таблиц Excel 2007. Для определения описательных числовых характеристик переменных применялись стандартные методики статистического анализа: расчет медианы, 0,5 и 99,5 перцентилей.
Для подтверждающей молекулярно-генетической диагностики лейциноза проводили выделение ДНК из сухих пятен крови, используя набор реактивов DiatomDNAPrep (ООО «Биоком», Россия). Подбор праймеровдля ПЦР амплификации осуществляли для 10 экзонов генов BCKDHA и BCKDHB. Секвенирование ПЦР-фрагментов с целью выявления редких мутаций проводилось согласно протоколу фирмы-производителя на генетическом анализаторе ABIPrism 3500 (AppliedBiosystem, США).
Результаты исследования и их обсуждение
В результате исследования концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови 438 клинически здоровых новорожденных детей были определены 0,5 и 99,5 перцентиликонцентраций исследованных метаболитов, которые использовались нами в дальнейшем как референсные значения (табл. 2). Сопоставление концентраций аминокислот и ацилкарнитинов, определенных в образцах крови 86 умерших на первом году жизни детей, с референсными значениями концентраций, показало, что у 82 пациентов (95,3 %) ни один из исследуемых показателей не выходил за пределы 0,5 и 99,5 перцентилей контрольной группы, что позволило отказаться от рабочей версии о наличии у них нарушений обмена аминокислот и карнитинов, не верифицированных прижизненно. Однако у 4 детей (4,7 %) концентрации некоторых аминокислот и ацилкарнитиновв несколько раз превышали верхние границы референсного интервала контрольной группы (табл. 2).
Таблица 2
Результаты ретроспективной оценки концентраций аминокислот и ацилкарнитинов у новорожденных (n=4) с уровнем отдельных метаболитов вне диапазона 0,5-99,5 перцентилей
№ |
Метаболиты |
Концентрации отдельных метаболитов (мкмоль/л) |
||||
Референсные значения контрольной группы (n= 438) в диапазоне 0,5-99,5 перцентилей |
Индивидуальные значения пациентов (n=4) *
|
|||||
Пациент 1 |
Пациент 2 |
Пациент 3 |
Пациент 4 |
|||
А м и н о к и с л о т ы |
||||||
1. |
Ala |
63,68 - 667,82 |
77,191 |
696,2 |
376,3 |
1454,7 |
2. |
Asp |
25,76 - 226,2 |
146,482 |
38,309 |
192,888 |
116,147 |
3. |
Glu |
262,2 - 1310,89 |
138,718 |
239,486 |
944,055 |
875,559 |
4. |
Xle |
55,4 - 266,92 |
2503,868 |
568,038 |
374,191 |
476,129 |
5. |
Met |
7,02 - 28,99 |
2,192 |
39,939 |
11,595 |
49,706 |
6. |
Phe |
23,09 - 94,94 |
40,907 |
138,571 |
77,324 |
239,842 |
7. |
Tyr |
20,08 - 171,45 |
16,783 |
25,600 |
41,963 |
204,371 |
8. |
Val |
41,53 - 196,87 |
654,143 |
351,693 |
138,619 |
283,070 |
9. |
Arg |
4,93 - 37,75 |
23,095 |
88,849 |
24,646 |
38,014 |
10. |
Cit |
4,75 - 33,57 |
17,517 |
10,448 |
34,673 |
30,834 |
11. |
Gly |
179,3 - 979,0 |
285,120 |
312,969 |
523,159 |
1457,474 |
12. |
Orn |
39,2 - 354,51 |
31,392 |
43,233 |
265,230 |
139,048 |
А ц и л к а р н и т и н ы |
||||||
13. |
C0 |
7,54-69,9 |
39,077 |
30,547 |
31,548 |
109,293 |
14. |
C2 |
6,14-63,92 |
2,448 |
4,402 |
5,315 |
35,754 |
15. |
C3 |
0,4-4,43 |
1,114 |
0,888 |
0,351 |
1,494 |
16. |
C3DC |
0,023-0,16 |
0,037 |
0,013 |
0,094 |
0,073 |
17. |
C4 |
0,06-0,7 |
0,109 |
0,187 |
0,618 |
1,319 |
18. |
C4DC |
0,091-0,56 |
0,109 |
0,055 |
0,177 |
0,171 |
19. |
C5 |
0,05-0,39 |
0,057 |
0,213 |
0,483 |
0,564 |
20. |
C5DC |
0,003-0,24 |
0,023 |
0,063 |
0,298 |
0,334 |
21. |
C5:1 |
0-0,03 |
0,014 |
0,010 |
0,119 |
0,027 |
22. |
C5OH |
0,047-0,27 |
0,088 |
0,066 |
0,380 |
0,168 |
23. |
C6 |
0,008-0,1 |
0,063 |
0,030 |
0,142 |
0,170 |
24. |
C8 |
0,016-0,14 |
0,038 |
0,024 |
0,192 |
0,240 |
25. |
C8:1 |
0,019-0,12 |
0,031 |
0,036 |
0,049 |
0,173 |
26. |
C10 |
0,024-0,21 |
0,060 |
0,040 |
0,177 |
0,117 |
27. |
C10:1 |
0,01-0,07 |
0,014 |
0,021 |
0,152 |
0,149 |
28. |
C12 |
0,098-1,06 |
0,139 |
0,178 |
0,293 |
0,176 |
29. |
C14 |
0,05-0,421 |
0,085 |
0,141 |
0,191 |
0,129 |
30. |
C14:1 |
0,04-0,34 |
0,084 |
0,083 |
0,135 |
0,072 |
31. |
C14:2 |
0,007-0,04 |
0,026 |
0,010 |
0,028 |
0,030 |
32. |
C14OH |
0,003-0,05 |
0,008 |
0,006 |
0,115 |
0,021 |
33. |
C16 |
0,72-6,41 |
0,404 |
1,995 |
1,622 |
1,499 |
34. |
C16:1 |
0,031-0,35 |
0,043 |
0,158 |
0,209 |
0,141 |
35. |
C16:1OH |
0,011-0,07 |
0,020 |
0,017 |
0,089 |
0,032 |
36. |
C16OH |
0,01-0,05 |
0,022 |
0,011 |
0,190 |
0,020 |
37. |
C18 |
0,24-1,51 |
0,154 |
0,287 |
0,483 |
0,521 |
38. |
C18:1 |
0,29-2,34 |
0,423 |
0,591 |
0,776 |
0,833 |
39. |
C18OH |
0,005-0,02 |
0,006 |
0,003 |
0,036 |
0,003 |
40. |
C18:1OH |
0,006-0,03 |
0,008 |
0,005 |
0,063 |
0,014 |
41. |
C18:2OH |
0-0,01 |
0,003 |
0,002 |
0,006 |
0,002 |
* Примечание:
Пациент 1 - мальчик КМ (диагноз: обструктивный бронхиолит), умер в возрасте 11 месяцев;
Пациент 2 - мальчик КФ (диагноз: пневмония), умер в возрасте 1 месяца;
Пациент 3 - девочка ЛВ (диагноз: сепсис), умер в возрасте 12 суток.
Пациент 4 - девочка ПА (диагноз: пневмония), умерла в возрасте 6 суток.
В первом случае у пациента КМ, умершего в возрасте 11 месяцев, с диагнозом обструктивный бронхиолит, тандемная масс-спектрометрия аминокислот и ацилкарнитинов в архивных образцах крови выявила изменения содержания лейцина, изолейцина и валина, которые носят достаточно специфический характер, чтобы говорить о высокой вероятности врожденного метаболического дефекта в пути катаболизма лейцина и изолейцина. В исследованных архивных образцах крови обнаружено увеличение концентрации лейцина и изолейцина более чем в 9 раз и валина - более чем в 3 раза по сравнению с референсными значениями, что позволяет предположить диагноз «болезни с запахом мочи кленового сиропа» [1, 2, 4].
Из имеющихся клинических данных в пользу лейциноза у ребенка КМ свидетельствовали следующие клинические проявления: ранний отказ от естественного вскармливания, симптомы неонатальной энцефалопатии, нарастание неврологической симптоматики - изменения мышечного тонуса, судороги, эпилепсия, задержка психомоторного развития. У ребенка часто наблюдались инфекционные заболевания дыхательных путей с тяжелым течением, которые стали причиной облитерирующего бронхиолита, явившегося причиной летального исхода в возрасте 11 месяцев. Мы не обладаем информацией о том, был ли у ребенка специфический запах мочи, но увеличение концентрации типичных для лейциноза метаболитов и характерная клиническая симптоматика подтверждают наше предположение. Кроме того, в пользу диагноза болезни запаха мочи кленового сиропа свидетельствуют результаты проведенной ДНК диагностики лейциноза с использованием архивных образцов крови. Молекулярно-генетический анализ позволил выявить у ребенка делецию с.98delG в первом экзоне гена BCKDHB в гетерозиготном состоянии. Эта же мутация обнаружена в крови матери. Ввиду ограниченного количества архивных образцов крови ребенка и недоступности биологического материала его отца вторую мутацию обнаружить не удалось. Тем не менее, совокупность клинических, биохимических и молекулярно-генетических данных подтверждают диагноз лейциноза (или болезни с запахом мочи кленового сиропа, MIM ID 248600) в изученном случае.
В остальных трех случаях выявленные изменения профиля аминокислот и ацилкарнитинов не носят такого же специфического характера, как в предыдущем случае. Предполагать определенные НБО, основываясь на данных МС/МС,тем более - утверждать с достоверностью, в этих случаях невозможно. Для дифференциальной диагностики аминоацидопатий и органических ацидурий необходимы были бы повторные исследования крови методом МС/МС, дополнительные клинические и биохимические исследования.
Степень повышения специфичных для заболеваний метаболитов вариабельна и зависит от многих факторов. Характер питания ребенка, прием некоторых лекарственных препаратов должны учитываться при интерпретации результатов. Так, прием препаратов, содержащих вальпроевую кислоту или среднецепочечные триглицериды, приводит к повышению С6, С8 и С10, что затрудняет диагностику недостаточности среднецепочечной ацил-КоАдегидрогеназы. Прием карнитинсодержащих лекарственных препаратов также может приводить к повышению концентраций коротко- и среднецепочечных ацилкарнитинов. Содержание длинноцепочечных ацилкарнитинов в плазме и цельной крови различно, поскольку они ассоциированы с мембранами эритроцитов, следовательно, показатель гематокрита имеет определенное значение. За некоторым исключением, полутора - двукратное увеличение концентрации требует повторного анализа крови. Так, патогномоничные для пропионовой и изовалериановой ацидурии уровни метаболитов обычно повышаются более чем в 5 раз, а даже незначительное изменение концентрации глутарилкарнитина требует не только повторного анализа крови, но и дополнительного исследования органических кислот мочи, характерных для глутаровой ацидурии I типа [6, 7].
Заключение
Проведенное методом МС/МС ретроспективное исследование образцов крови детей раннего возраста, умерших от различных причин, позволило предположить в ряде случаев наследственную патологию обмена веществ. В одном из них подтвержден диагноз болезни запах мочи кленового сиропа (лейциноз). Своевременные диагностические мероприятия в подобных случаях являются важной составляющей в дифференциальной диагностике врожденных ошибок метаболизма. Исследование концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в образцах биологических жидкостей может иметь диагностическую ценность в анализе случаев младенческой смертности. Посмертно установленный диагноз наследственного заболевания обмена веществ у умершего ребенка является показанием для медико-генетического консультирования семьи. Необходимо широкое внедрение метода МС/МС в неонатальный скрининг как основного инструмента для выявления аминоацидопатий, органических ацидемий и дефектов β-митохондриального окисления жирных кислот у новорожденных для своевременной диагностики и лечения НБО.
Рецензенты:
Полевиченко Елена Владимировна, д-р мед. наук, профессор, главный научный сотрудник отдела реабилитации и медико-социальной помощи ФГБУ «ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России, г. Москва.
Михайлова Светлана Витальевна, д-р мед. наук, заведующая отделением медицинской генетики ФГБУ «Российская детская клиническая больница Минздрава России», г. Москва.
Библиографическая ссылка
Байдакова Г.В., Антонец А.В., Голихина Т.А., Матулевич С.А., Амелина С.С., Куцев С.И., Куцев С.И. РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=8953 (дата обращения: 30.09.2023).