Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ОБРАЗОВАНИЯ ФИБРИЛЛ БЕЛКА YB-1 С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ И АНАЛИТИЧЕСКОГО УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ

Мачулин А.В. 1 Хечинашвили Н.Н. 2
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)
2 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН)
С помощью методов атомно-силовой микроскопии (АСМ) и аналитического ультрацентрифугирования (АУ) была исследована кинетика образования фибриллярных структур белком YB-1. Измеренные гидродинамические параметры свежеприготовеленного белка YB-1 (коэффициент седиментации, молекулярная масса) в условиях высокой (2М LiCl) и умеренной (150 мМ KCl) ионной силы соответствовали мономерам белка, что коррелирует с полученными АСМ-изображениями. Рассчитанный гидродинамический объем этих мономеров в растворе примерно равен объему белка, адсорбированному на поверхности слюды (по данным АСМ). После трех суток инкубации белка в условиях высокой ионной силы точное определение константы седиментации стало невозможным, а структуры, наблюдаемые на АСМ-изображениях, представляли собой протяженные фибриллы. В условиях умеренной ионной силы в процессе инкубации белок YB-1 не полимеризовался.
атомно-силовая микроскопия
аналитическое ультрацентрифугирование
белок YB-1
1. Елисеева И. А. и др. Y-бокс-связывающий белок 1 (YB-1) и его функции // Успехи биологической химии. - 2011. - Т. 51. - С. 65-132.
2. Селиванова О. М. и др. Белок YB-1 обладает способностью образовывать протяженныенанофибриллы // Биохимия. - 2010. - Т. 75, N 5. - С. 629-636.
3. Сeрдюк И. Н., Евсеева О. Н. Новые возможности аналитического ультрацентрифугирования для анализа гидродинамических свойств белков // Успехи биологической химии. - 2006. - Т. 46. - С. 349-372.
4. Binnig G., Quate C., Gerber C. Atomic force microscope// Phys. Rev. Lett. - 1986. - №56 - P. 930-934.
5. Edstrom R. D.et al. Direct visualization of phosphorylase-phosphorylase kinase complexes by scanning tunneling and atomic force microscopy // Biophys. J. - 1990. - V.58. - P.1437-1448.
6. Guryanov S. G.et al. Formation of amyloid-like fibrils by y-box binding protein 1 (YB-1) is mediated by its cold shock domain and modulated by disordered terminal domains // PLoS ONE. - 2012. - V. 7, № 5. - P. e36969.
7. Kloks C. P. A. M. et al. The solution structure and DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein YB-1// J. Mol. Biol. - 2002. - V.316. - P. 317-326.
8. Kohno K. The pleiotropic functions of theY-box-binding protein, YB-1// BioEssays. - 2003. - V.25. - P.691-698.
9. Schneider S. W.et al. Molecular weights of individual proteins correlate with molecular volumes measured by atomic force microscopy// Pflugers. Archiv. European Journal of Physiology. - 1998. - V. 434, №3. - P. 362-367.
10. Schuck P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling // Biophys. J. - 2000. - V.78. - P. 1606-1619.
ВВЕДЕНИЕ

Белок YB-1 - многофункциональный ДНК- и РНК-связывающий белок млекопитающих, участвующий в различных внутриклеточных процессах, связанных с хранением, воспроизведением и экспрессией генетической информации, и функционирующий как в ядре, так и в цитоплазме. YB-1 может взаимодействовать с актиновым и тубулиновым цитоскелетами, а также секретироваться из клеток и выступать в качестве экстраклеточного регулятора различных процессов в организме [1].

YB-1 содержит 324 а. о. и состоит из трех доменов [8]. На N-конце находится небольшой домен, богатый аланином и пролином, далее идет домен холодового шока (CSD) [7], а за ним - протяженный C-концевой домен, состоящий из чередующихся кластеров положительно и отрицательно заряженных аминокислотных остатков, с размером каждого кластера примерно в 25-30 остатков. Данные о том, каким образом неструктурированные N- и C- домены белка располагаются относительно CSD-домена, отсутствуют.

Ранее, с помощью АСМ было показано, что инкубация белка YB-1 в 20 мМ Hepes-KOH, pH 7.6, 2 MLiCl приводит к образованию фибрилл [2]. Для того чтобы приблизиться к пониманию процесса фибриллогенеза белка YB-1, необходимо выявить параметры протофибрилл, определяющих их функциональное состояние и упаковку в протяженные фибриллы. Кроме того, определение влияния внешних условий на процесс фибриллогенеза даст возможность получать фибриллы с регулируемыми свойствами.

Целью данной работы было исследование кинетики образования фибриллярных структур белком YB-1 с помощью методов атомно-силовой микроскопии (АСМ) [4] и аналитического ультрацентрифугирования (АУ) [3].

Материалы и методы

Очистка белка YB-1 и образование фибрилл

Белок YB-1 получали, как описано ранее [2]. Для получения фибрилл белка YB-1 концентрированный препарат белка размораживали и доводили его концентрацию до 0.1 мг/мл буфером 20 мМHEPES-KOH, pH 7.6, содержащем 2MLiCl или 150мМKCl. Препарат белка прогревали в течение 15 мин при 30 ºС, дальнейшую инкубацию белка проводили при 4 ºС.

Атомно-силовая микроскопия

Сканирование осуществлялось на приборе Интегра-Вита («НТ-МДТ», Зеленоград) в полуконтактном режиме. В работе использовались стандартные кремниевые кантиливеры NSG 03 длиной 100 мкм, с резонансной частотой 62-123 кГц и радиусом закругления острия 10 нм.

Для исследования методом АСМ все образцы готовились одинаково следующим образом. На свежесколотую слюду помещали каплю раствора белка объемом 5-10 мкл. После этого слюду с нанесенным раствором помещали во влажную атмосферу, для предотвращения высыхания капли, и выдерживали в течение 5 минут. Затем каплю раствора удаляли фильтрованной бумагой и подложку с образцом, не высушивая, дважды промывали в дистиллированной воде в течение 30 секунд для удаления не адсорбированного вещества. После промывания подложку с образцом высушивали на воздухе.

Аналитическое ультрацентрифугирование

Эксперименты по АУ проводились на центрифуге BeckmanXL (BeckmanCoulter) на скорости 40000 об/мин при 20 °C. Распределения дифференциального коэффициентаc(s) и c(M) рассчитывались с помощью программы SEDFIT [10]. Расчеты коэффициентов седиментации проводились с поправкой на температуру и ионную силу буферного раствора.

результаты исследования и их обсуждение

Анализ свежеприготовленного белка YB-1 в условиях высокой (2 М LiCl) и низкой (150 мМ КCl) ионных силахметодами АУ и АСМ

Седиментационный анализ свежеприготовленного белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2М LiCl приведен на рисунке 1А. Как видно из рисунка, распределение по константе седиментации и по молекулярной массе унимодально. Вычисляемая величина константы седиментации s составляет, s20w = 2.72 S. Вычисляемая молекулярная масса М составляет 35.3 кДа, что всего лишь на 2 % меньше теоретической величины, рассчитанной из первичной последовательности (36 кДа). Отметим, что константа седиментации равная 2.72 S соответствует  глобулярному белку в растворе.

Седиментационный анализбелка YB-1 в условиях умеренной ионной силы 150мМ KCl (свежеприготовленный) дает константу седиментации равную 2.80 S, что также соответствует  глобулярному белку в растворе (рис.1 В). Вычисляемая молекулярная масса М при этом равна 36.2 кДа.

То, что свежеприготовленный белок находится в глобулярном состоянии, подтверждается полученными АСМ изображениями мономеров белка на подложке (рис. 1 Б, Г). Таким образом, можно утверждать, что на начальном этапе ионные условия не влияют на конформацию белка в растворе. Кроме того, из этого следует, что в растворе неструктурированные N- и C- домены белка располагаются компактно вокруг доменахолодового шока.

Рис. 1. А - седиментационный профиль белка YB-1 в условиях высокой ионной силы (2 MLiCl). Основной график иллюстрирует распределение седиментационной постоянной, а вложенный график иллюстрирует распределение молекулярной массы. Б - АСМ изображение мономеров белка YB-1 в условиях высокой ионной силы (2MLiCl). В - седиментационный профиль белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы (150мМ КCl). Основной график - распределение седиментационной постоянной, а  вложенный график - распределение молекулярной массы. Г - АСМ изображение мономеров белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы (150мМ КCl)

Объем YB-1 в растворе (АУ)  и на подложке (АСМ)

Несмотря на то, что при взаимодействии с зондом высота и ширина биологических объектов получается отличной от реальной, расчет объема белковых молекул по данным атомно-силовой микроскопии дает весьма достоверные результаты. Кроме того, многие работы [9] указывают на то, что объем глобулярных белков, измеряемый АСМ, коррелирует с молекулярной массой.

В первом приближении объем белка в растворе можно рассчитать по формуле [5]:

V = (M0/N0)(Vl + dV2),

где  M0 - молекулярный масса белка, N0 - число Авогадро, Vl и V2 - парциальные удельные объемы белка  (0.74 см3·г-1 и 1 см3·г-1 в растворе, соответственно), d - степень гидратации белка (0.4 моль H2O/моль белка).

Для мономера белка YB-1(молекулярная масса 36 кДа)  в растворе имеем  гидродинамический объем равный:

Vгидр = 68.17 нм3

АСМ-изображение свежеприготовленного белка YB-1 в условиях умеренной ионной силы представлено на рисунке 1 Г. Хорошо видно, что белок находится в мономерной форме. Анализируя АСМ-изображения мономеров белка YB-1, были получены средние значение высоты, которая составила 0.42 нм и средний диаметр на половине максимальной высоты, который был равен 34 нм.

Для оценки объема микрочастиц белка из АСМ изображений применяем формулу для сегмента сферы:

V = (h/6) (3r2 + h2),

где h - высота молекулы белка, r - радиус белка.

Для измеренных с АСМ-изображений параметров (среднее значение высоты и ширины высчитывалось по профилю сечения для набора частиц), получаем:

VАСМ= 60.7 ± 7.0 нм3

Таким образом, объем белка YB-1 на подложке по данным АСМ на 11 %  меньше такового, рассчитанного по гидродинамическим параметрам.

Кинетика образования фибриллярных структур белком YB-1

После инкубации белка YB-1 в условиях высокой ионной силы 2 М LiCl в течение суток наблюдалось изменение седиментационного профиля (рис. 2 А). На рисунке видно второй меньший пик, константа седиментации которого соответствует димеру белка. Через трое суток точное определение константы седиментации становится невозможным, а молекулярная масса отдельных образованных в растворе структур становится 7∙106 Да, что говорит о прошедшей в растворе процессе полимеризации вещества (рис. 2Б). При этом структуры, наблюдаемые на АСМ-изображениях, представляют собой протяженные фибриллы, что коррелирует с полученными гидродинамическими данными (рис. 2В),  а также с полученными раннее данными других работ [2, 6].

Рис. 2. А - седиментационный профиль белка YB-1 после суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2MLiCl). Основной график - распределение седиментационной постоянной, вложенный график - распределение молекулярной массы. Б - седиментационный профиль белка YB-1 после трех суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2MLiCl). Основной график - распределение седиментационной постоянной, вложенный график - распределение молекулярной массы. В - АСМ изображение фибрилл белка YB-1 после трех суток инкубации в растворе в условиях высокой ионной силы (2MLiCl)

В условиях умеренной ионной силы в процессе инкубации белок YB-1 коэффициент седиментации не изменялся, что свидетельствует об отсутствии процесса полимеризации.

Заключение

В данной работе с помощью методов АСМ и АУ было показано, что свежеприготовленный белок YB-1 находится в глобулярной мономерной форме и ионные условия не влияют на его конформацию в растворе. Это говорит о том, что в растворе неструктурированные N- и C- домены белка располагаются компактно вокруг доменахолодового шока. Рассчитанный гидродинамический объем мономеров белка YB-1 в растворе равен 68.17 нм3, а объем белка, адсорбированного на поверхности слюды (по данным АСМ) - 60.7 нм3. После трех суток инкубации  белка в условиях высокой ионной силы определение его константы седиментации из АУ было невозможно, что согласуется с полученными ранее АСМ-данными об образуемых фибриллярных структурах. Можно заключить, что структурной единицей, инициирующей возникновение протофибрилл и последующее развитие процесса образования протяженных фибрилл, является димерная форма белка YB-1.

 

Авторы выражают благодарность Гурьянову С. Г. (Институт Белка РАН) за предоставленный препарат белка YB-1 и Тимченко А. А. (Институт Белка РАН) за помощь в проведении экспериментов по АУ.

 

Рецензенты:

  • Кутышенко Виктор Павлович, д.ф.-м.н., профессор, зав. лабораторией «ЯМР-исследований биосистем», Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г. Пущино.
  • Новосёлова Елена Григорьевна, д.б.н., профессор, главный научный сотрудник, Институт биофизики клетки РАН (ИБК РАН), г. Пущино.

Библиографическая ссылка

Мачулин А.В., Хечинашвили Н.Н. ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ОБРАЗОВАНИЯ ФИБРИЛЛ БЕЛКА YB-1 С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ И АНАЛИТИЧЕСКОГО УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 5. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=7164 (дата обращения: 20.09.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074