Одной из наиболее изученных моделей является острая стресс-индуцированная атрофия тимуса, при которой ключевое значение принадлежит глюкокортикоидным гормонам. Известно, что глюкокортикоиды реагируют с рецепторами тимоцитов и запускают их апоптоз [9]. Хронический стресс также вызывает инволюцию тимопоэтического компонента железы с последующей структурной перестройкой органа и его атрофией, при этом изменения в железе схожи с возрастной инволюцией, но протекают значительно быстрее [4]. Ряд авторов указывают на возможность кратковременного, но обратимого негативного влияния хирургического стресса на тимус [1].
Спленэктомия - широко распространенная хирургическая операция, выполняемая при травматических разрывах органа и операциях на органах верхнего этажа брюшной полости. Однако удаление это крупнейшего периферического органа иммуногенеза приводит к перестройке цепи взаимодействия иммунокомпетентных органов и снижению защитных сил, а в ряде случаев - развитием синдрома OPSI (overwhelming post-splenectomy infection) [10].
В предыдущих работах мы установили, что спленэктомия вызывает акцидентальную инволюцию тимуса, признаки которой сохраняются даже через 120 суток после операции. Нами показано, что спленэктомия сопровождается стойким увеличением уровня кортизола в крови, анемией, а также увеличением уровня биогенных аминов в структурах тимуса на фоне инволютивных изменений [2]. Таким образом, было установлено, что влияние спленэктомии на тимус не ограничивается лишь хирургическим стрессом и имеет более сложные механизмы, основанные на нарушениях нейроэндокринных и гуморальных взаимодействий. Тогда же было высказано предположение, что механизм акцидентальной инволюции может быть опосредован через клетки APUD серии и дендритные клетки (ДК) тимопоэтического микроокружения.
Цель исследования - установление морфологических характеристик, иммуногистохимического фенотипа и особенностей цитоархитектоники клеток тимопоэтического компонента вилочковой железы при вторичной иммунной недостаточности после спленэктомии.
Материалы и методы исследования. Работа выполнена на 42 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-220 грамм в возрасте 5 месяцев. Уход и содержание животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы были разделены на три группы. Животным первой группы (22 крысы) под общей анестезией выполняли спленэктомию с соблюдением правил асептики и антисептики. Животным второй группы - ложнооперированные (10) - выполняли лапаротомию без удаления селезенки. Третью группу составили интактные животные (10) соответствующего возраста. Контролем служили интактные и ложнооперированные крысы. Выведение всех групп животных из эксперимента проводилось через 30 и 120 суток после операции путем декапитации. Объектом исследования служил тимус. В работе использованы следующие методы:
1. Иммуногистохимический метод с использованием пяти коммерческих моноклональных (МКАТ) и поликлональных (ПКАТ) антител фирм Santa Cruze (США) и NovoСastra (Великобритания):
а) МКАТ к кластеру дифференцировки лимфоцитов 3 типа;
б) ПКАТ к белку S-100 (маркер нейроэктодермы);
в) МКАТ к синаптофизину (маркер нейроэндокринных клеток);
г) МКАТ к мульти цитокератинам (маркер эпителиальных клеток);
д) МКАТ к белку-регулятору апоптоза р53.
Материал для исследования иммуногистохимическими методами фиксировали 10 % нейтральным забуференным формалином в течение 24 ч, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 4 мкм. Срезы наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали при температуре 37 0С в течение 18 часов. Демаскировка и иммуногистохимическая окраска проводилась на автостейнере Leica Bond Max (Германия). Контролем иммуногистохимической реакции служила неиммунизированная кроличья и мышиная сыворотка. Результат реакции оценивали с применением микроскопа Leica DM4000B (Германия) путем подсчета позитивно окрашенных клеток на 100 клеток в десяти полях зрения при увеличении x400, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения.
2. Окраска срезов тимуса гематоксилином и эозином для проведения морфометрических измерений.
3. Компьютерная морфометрия с использованием лицензионных программ Leica application suite 3.6.0 (Германия) и Микроанализ (Россия).
4. Статистическая обработка с использованием лицензионного пакета программ MS Office 2003, достоверность определялась t-критерием Стьюдента.
Результаты собственных исследований и обсуждение. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов тимуса интактных крыс 6 месяцев антителами к цитокератинам выявляет развитую сеть эпителиальных клеток коркового и мозгового вещества. Эпителиальные клетки занимают 8,3 % площади среза коркового и 21,9 % мозгового вещества дольки (рисунки 1, 2). Окраска антителами к белкам S-100 и синаптофизину выявляет многочисленные клетки нейроэктодермального и нейроэндокринного происхождения, которые локализуются в мозговом веществе и на границе коркового и мозгового вещества. Количество клеток, дающих положительную реакцию с белком S-100, достигает 18,4±2,98 в поле зрения, с синаптофизином - 12,8±3,05. Обработка срезов тимуса антителами к антиапоптотическому белку p-53 выявляет немногочисленные клетки, локализованные в корковом и мозговом веществе, число которых не превышает 6,04 ±1,7 клетки в поле зрения. Окраска тимуса антителами к CD 3 выявляет многочисленные зрелые тимоциты коркового и мозгового вещества, которые занимают 12,3 % площади коркового и 53,1 % площади мозгового вещества.
В тимусе интактных крыс 9 месяцев выявляются признаки возрастной инволюции, которые выражены в снижении массы железы, уменьшении площади дольки и мозгового вещества, а также толщины коркового слоя, но эти морфологические характеристики меняются недостоверно, тогда как количественные показатели иммуногистохимических реакций подвержены существенным изменениям. Установлено, что в тимусе интактных крыс 9 месяцев достоверно возрастает число кортикальных эпителиоцитов, которые занимают 15,7 % (P˂0,01) площади дольки. В мозговом же веществе отмечено достоверное уменьшение числа этих клеток до 16,9 % (P˂0,01). Окраска препаратов тимуса интактных крыс 10 месяцев антителами к белкам S-100 и синаптофизину выявляет существенное увеличение числа клеток, дающих положительную реакцию, до 34,3±5,3 (P˂0,01) и 22,5±3,45(P˂0,01) соответственно. Обработка тимуса антителами к антиапоптотическому белку p-53 выявляет достоверное увеличение числа клеток, экспрессирующих этот антиген, до 26,8±5,78 (P˂0,001) в поле зрения, при этом клетки располагаются преимущественно периваскулярно. Количество зрелых кортикальных тимоцитов, дающих реакцию с CD 3, возрастает до 28,76 % (P˂0,01), тогда как в мозговом веществе снижается до 35,67 % (P˂0,01). Следует отметить, что изменения в тимусе ложнооперированных крыс на всех сроках достоверно не отличались от значений у интактных животных.
Таким образом, возрастная инволюция сопровождается изменением соотношения эпителиальных клеток в тимической паренхиме с уменьшением их количества в мозговом веществе, повышением экспрессии антиапоптотического белка p-53 в структурах дольки, увеличением количества клеток нейроэктодермального и нейроэндокринного происхождения, а также разнонаправленным изменением количества зрелых тимоцитов в корковом и мозговом веществе.
Через месяц после удаления селезенки отмечается уменьшение средней массы тимуса, а также площади мозгового и толщины коркового вещества по сравнению с интактными крысами. Окраска препаратов тимуса крыс через месяц после спленэктомии антителами к цитокератинам выявляет достоверное уменьшение количества эпителиальных клеток в мозговом веществе до 13,9 (P˂0,01), тогда как их количество в корковом веществе меняется не достоверно. Обработка срезов антителами к синаптофизину выявляет достоверное увеличение клеток, экспрессирующих этот антиген, до 19,6±0,7 (P˂0,01) клеток в поле зрения, тогда как число клеток, экспрессирующих S-100, меняется не достоверно. При исследовании антиапоптотического белка p-53 выявлено его достоверное повышение до 8,62 ±0,24 (P˂0,01) клеток в поле зрения. Значимых изменений в количестве зрелых тимоцитов в дольке по сравнению с животными из групп контроля не выявлено.
Через 120 суток после спленэктомии дольки тимуса уменьшены в размерах, в них с трудом прослеживается граница между корковым и мозговым веществом. Междольковые септы расширены и заполнены жировой тканью, на периферии железы определяются скопления крупных клеток с оксифильной цитоплазмой без лимфоцитов. Окраска препаратов тимуса антителами к цитокератинам выявляет густую сеть эпителиальных клеток в сохраненных дольках, а в периферических отделах тимуса - поля эпителиальных клеток без лимфоцитов (рисунки 3,4). При помощи компьютерной морфометрии установлено, что эпителиоциты занимают 20,3 % площади коркового и 22,09 % площади мозгового вещества, однако их количество превышает значения у интактных крыс недостоверно. При обработке препаратов антителами к белкам S-100 и синаптофизину выявляются многочисленные клетки нейроэктодермального и нейроэндокринного происхождения, количество которых достоверно выше (P˂0,01), чем у интактных и ложнооперированных животных (рисунок 4). Окраска антителами к белку-регулятору апоптоза p-53 демонстрирует недостоверное увеличение количества клеток, экспрессирующих этот антиген по сравнению с интактными и ложнооперированными крысами. Исследование экспрессии CD 3 выявило достоверное снижение количества зрелых тимоцитов в мозговом веществе тимуса (P˂0,01), тогда как количество этих клеток в корковом веществе изменяется не достоверно.
Таким образом, инволюция тимуса после спленэктомии сопровождается увеличением числа эпителиальных клеток, достоверным уменьшением количества зрелых тимоцитов в мозговом веществе, а также достоверным повышением количества клеток нейроэндокринного и нейроэктодермального происхождения. Мы считаем, что увеличение количества эпителиальных клеток и в корковом, и в мозговом веществе дольки, вероятно, является относительным и обусловлено уменьшением числа тимоцитов. Известно, что спленэктомия сопровождается длительным повышением уровня кортизола [2], который нарушает поступление в железу костномозговых предшественников и может усиливать апоптоз [6]. В наших экспериментах показано, что спленэктомия сопровождается достоверным уменьшением количества зрелых тимоцитов в мозговом веществе тимуса, при этом увеличения экспрессии белка-регулятора апоптоза p-53 в его структурах не наблюдается.
Мы также установили, что спленэктомия приводит к увеличению числа клеток тимопоэтического окружения, экспрессирующих белки S-100 и синаптофизин. Известно, что в тимусе позитивную реакцию с маркером нейроэктодермальной дифференцировки S-100 дают медуллярные ДК и некоторые популяции эпителиальных клеток, входящие в состав периваскулярных пространств медуллярной зоны (PVS), а с синаптофизином - нейроэндокринные клетки медуллярной зоны, которые причисляют к клеткам АПУД-серии [3, 7]. Нейромедиаторы, выделяемые нейроэндокринными клетками, регулируют деятельность клеток микроокружения тимоцитов и секрецию ими гормонов и интерлейкинов, которые, в свою очередь, необходимы для созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов. Кроме того, нейромедиаторы и белки, выделяемые ДК и клетками APUD-серии, регулируют пролиферацию и апоптоз тимоцитов [8]. Мы считаем, что увеличение числа этих клеток может быть обусловлено как изменением соотношения тимоцитов к компонентам микроокружения вследствие инволюции, так и реакцией этих структур на повышенный уровень кортизола.
Заключение. Таким образом, изменения тимуса в первые четыре месяца после спленэктомии имеют иммунофенотипические и морфологические отличия от возрастной инволюции у крыс соответствующего возраста, при этом они протекают иначе, чем стресс-индуцированная острая атрофия. Вероятно, инволюция тимуса после спленэктомии имеет более сложные патогенетические механизмы, чем стресс-индуцированная атрофия, и реализована через структуры тимопоэтического микроокружения с изменением гормонального и цитокинового профиля и последующим снижением тимопоэза, без прямой стимуляции апоптоза тимоцитов.
Работа выполнена в рамках гос. контракта № 02.740.11.0708 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
Рисунки
Рисунок 1. Тимус интактной крысы 6 месяцев. Скопления эпителиальных клеток в корковом веществе. Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400
Рисунок 2. Тимус интактной крысы 6 месяцев. Эпителиальные клетки мозгового вещества, формирующие подобие «сети». Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400
Рисунок 3. Тимус спленэктомированной крысы 9 месяцев. Увеличение числа эпителиальных клеток коркового вещества в сохраненной дольке. Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400
Рисунок 4. Тимус спленэктомированной крысы 9 месяцев. Атрофированная периферическая долька, состоящая из скоплений эпителиальных клеток без лимфоцитов. Иммуногистохимическая реакция к цитокератинам, ув. 400
Рецензенты:
- Ямщиков Николай Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой гистологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ, г. Самара.
- Челышев Юрий Александрович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», г. Казань.
Библиографическая ссылка
Москвичев Е.В., Меркулова Л.М., Стручко Г.Ю. МОРФОЛОГИЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ТИМУСА ПРИ ВТОРИЧНОЙ ИММУННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 3. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=6313 (дата обращения: 08.10.2024).