Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Ляпина А.М. 1, 2 Полянина Т.И. 1 Ульянова О.В. 1 Елисеев Ю.Ю. 2 Телепнев М.В. 3 Мотин В.Л. 3 Федорова В.А. 1

---

1 ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии

2 ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России, Саратов, Россия

3 Университет Техаса, Медицинский Факультет, Галвестон, Техас, США

На модели инбредных мышей BALB/c показана эффективность применения иммуномодулятора полиоксидония в качестве адъюванта для индукции специфических антител к бактериальным рекомбинатным и химически очищенным антигенам Yersinia pestis и Chlamydia trachomatis в сравнении с классическими адъювантами – адъювантом Фрейнда и TiterMax. В наших экспериментах полиоксидоний стимулировал выработку достоверно более высоких титров специфических антител к изучаемым антигенам, позволил значительно сократить сроки иммунизации лабораторных животных, легко смешивался с растворами антигенов, не вызывал побочных сайд-эффектов у биомоделей, и, таким образом, является перспективным адъювантом для создания высокоэффективных субъединичных вакцин на основе специфических бактериальных антигенов, в том числе против инфекций, вызываемых внутриклеточными бактериями, в частности, патогенными иерсиниями и хламидиями.

Статья в формате PDF

120 KB

адъюванты

полиоксидоний

бактериальные антигены

гуморальный иммунный ответ

Yersinia pestis

Chlamydia trachomatis

1. Иллек Я.И. Эффективность полиоксидония при тяжелом течении пневмонии у детей / Я.И. Иллек, А.В. Галанина, А.Г.Зайцева // Иммунология. – 2003. – № 3. – С. 180-182.

2. Иммуномодулятор «Полиоксидоний» в профилактике и лечении гнойной хирургической инфекции / P.M. Хаитов, Т.Л. Щельцына, А.А. Бутаков и др. // Хирургия. – 1997. – № 1. – С. 49-54.

3. Клинические и иммуномодулирующие влияния полиоксидония для коррекции вторичного иммунодефицита у больных ишемической болезнью сердца, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа / А.Т. Тепляков, Л.А. Болотская, Т.В. Вдовина и др. // Иммунология. – 2008. – № 1. – С. 44-50.

4. Оценка реактогенности, безвредности и профилактической эффективности тривалентной профилактической полимер-субъединичной вакцины «Гриппол» при введении детям школьного возраста / Г.А. Ельшина, М.А. Горбунов, Т.А. Бектимиров и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2000. – № 2. – С. 50-54.

5. Полиоскидоний – иммуномодулятор последнего поколения: итоги трехлетнего клинического применения / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, А.В. Некрасов и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. – 1999. – № 3. – С. 3-6.

6. Получение препаративного количества мышиных диагностических антихламидийных антител путем направленного иммуногенеза / В.А. Федорова, В.А. Банникова, Ю.Ю. Елисеев и др. // Биотехнология. – 2005. – № 2. – С. 82-90.

7. Эпидемиологическая и экономическая эффективность иммунизации вакциной «Гриппол» при гриппе и ОРВИ у взрослых и детей / Р.В. Хаитов, А.В. Некрасов, Н.Г. Пушкова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2003. – № 3. – С. 83-86.

8. Correlates of immunity elicited by live Yersinia pestis vaccine / V.L. Braciale, M. Nash, N. Sinha, I.V. Zudina, V.L. Motin // NIH: Frontiers in Research / ed. V.S. Georgiev. – Totowa, NJ: Humana Press, 2008. – V. 1. – Ch. 49. – P. 473-480.

Современная вакцинопрофилактика ориентирована на создание субъединичных вакцин на основе рекомбинатных и химически очищенных высокоиммуногенных протективных антигенов. Особо актуальными являются разработки высокоэффективных препаратов специфической профилактики против особо опасных инфекций и социально значимых заболеваний, вызываемых внутриклеточными патогенами. Трудности формирования иммунитета к данной группе заболеваний связаны с особенностями взаимодействия микроба с клетками организма хозяина, что препятствует образованию адекватного стойкого клеточного и гуморального иммунного ответа.

Для стимуляции иммунного ответа в настоящее время предложена группа адьювантов - неспецифических стимуляторов иммунитета, применение которых в составе субъединичных вакцин позволяет значительно усилить гуморальный и клеточный ответ, а также снизить антигенную нагрузку на макроорганизм. Однако большинство классических адъювантов, демонстрирующих значительное усиление клеточного и гуморального звеньев иммунитета при иммунизации биомоделей, не могут быть использованы для человека ввиду токсичности компонентов, входящих в их состав. Синтезированный российскими учеными препарат полиоксидоний, производное полиэтиленпиперазина [5], демонстрирует хорошие иммуномодулирующие свойства и на протяжении многих лет используется при лечении острых и хронических заболеваний, сопровождающихся снижением иммунитета, таких как сахарный диабет, ожоговая болезнь, детские патологии с иммуносупрессией [1-3; 5]. Важно отметить, что полиоксидоний (ПО) был одобрен и включен в качестве адъюванта в состав противогриппозной вакцины «Гриппол» Российского производства [4; 7].

Таким образом, ПО представляется перспективным кандидатом как иммуномодулятор для создания субъединичных вакцинных препаратов на основе бактериальных антигенов.

Целью настоящей работы было изучение способности ПО стимулировать выработку специфических антител к антигенам внутриклеточных патогенов, возбудителей хламидиоза и чумы, в сравнении с другими известными современными иммуностимуляторами - адъювантом Фрейнда (ПАФ) и TiterMax (ТМС).

Материалы и методы

В работе были использованы высокоочищенные рекомбинатные антигены Pla, LcrV и YopM чумного микроба, эксперессированные в E. coli [8], а также химически очищенный специфический антиген Chlamydia trachomatis гликопептидной природы - С-аг, охарактеризованный ранее [6].

Указанные антигены в концентрациях 5-10 мкг/особь применяли для четырехкратной иммунизации отдельных групп (n=3) мышей BALB/c (ГУ НЦБМТ РАМН, лицензированный питомник филиала «Андреевка», Солнечногорский р-н, п. Андреевка) возрастом 6-8 недель по трем схемам: короткой (А), средней (В) и длинной (С). Каждую группу разделили на подгруппы в зависимости от иммуностимуляторов, использованных при первой иммунизации - ПО (НПО «Петровакс Фарм», Россия), ТМС (Sigma, США) или ПАФ (Sigma, США). Адъюванты смешивали в равных объемах (1:1) с каждым из антигенов и вводили внутрибрюшинно. Все последующие инъекции антигенов проводили без адъювантов, за исключением группы животных, иммунизированных с ПАФ, - данную группу при второй иммунизации обрабатывали неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). Временные интервалы между введением антигенов составляли 3 дня (схема А), 14 дней (схема В) и 21 день (схема С) (Федорова В.А., 2004).

Титры специфических антител в крови иммунизированных животных определяли на четвертый день после последней иммунизации в непрямом твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА). Сенситины в фосфатно-солевом буфере в концентрации 1-10 мкг/мл сорбировали на 96-луночный планшет («Медполимер», Россия). Для проявления реакции использовали конъюгат антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой хрена («Медгамал», Россия). В качестве хромогенного субстрата служил ABTS - 2,2`-azinobis (3-ethilbenzthiazoline sulfonisacid) (Sigma, США), результаты учитывали на ИФА-ридере StatFax 2100 (Awareness Technology, США) при длине волны 405 нм, с использованием отсекающего фильтра на 630 нм. Титр специфических антител определяли как превышающий в 2 раза значение оптической плотности в контрольных лунках ряда.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования проводили сравнение эффективности использования ПО и ПАФ для стимуляции гуморального иммунного ответа к С-аг у мышей в зависимости от схемы иммунизации. В нашем эксперименте показано, что наибольшие титры антител были получены при иммунизации животных по короткой схеме (A). При этом титры антихламидийных антител в группе мышей, обработанных ПО, в 8-16 раз превышали таковые в группе животных, обработанных С-аг совместно с ПАФ. При использовании средней схемы (В) для иммунизации биомоделей титры анти-С-аг-антител у них были ниже, чем у животных, обработанных по схеме А, однако в группе, обработанной С-аг с ПО, титры антител превышали таковые в группе ПАФ в 4-5 раз. При сравнении результатов, полученных в группе животных, иммунизированных по длинной схеме (С), не было обнаружено значимых отличий в титрах антител, полученных с помощью ПО и ПАФ (рис. 1).

Рис. 1. Сравнительные титры антител к C-аг у мышей BALB/c, иммунизированных по короткой (A), средней (В) и длинной (С) схемам иммунизации.

На следующем этапе проводили сравнение титров антител к одному из рекомбинатных антигенов чумного микроба - Pla  у животных, иммунизированных по схеме A с использованием трех адъювантов (табл. 1).

Таблица 1 - Определение в ТИФА титров антител к Pla у BALB/c мышей, иммунизированных с использованием различных адъювантов

При оценке результатов ТИФА было отмечено, что по сравнению с другими адъювантами применение ПО стимулировало выработку наиболее высоких титров антител при использовании предложенной схемы, на уровне или даже превышающих таковые, полученные с использованием ТМС. При этом различие в титрах анти-Pla-антител в группах, обработанных ПО и ПАФ, составило 32-64 раза.

Еще более значимые титры антител были получены при использовании ПО при иммунизации мышей по схеме А другими антигенами Y. pestis - Lcr V и Yop M, которые составили 1:51 200 - 1:102 400 и 1:6 400 - 1:12 800 соответственно.

Сравнимо высокие титры антител в наших экспериментах были получены в группе животных, обработанных ПАФ, только при использовании длинной схемы иммунизации (С) (табл. 2).

Таблица 2 - Сравнительные титры антител к рекомбинатным антигенам чумного микроба у мышей BALB/c, иммунизированных по схеме С

Следует отметить, что использование адъювантов на основе минеральных и синтетических масел (ПАФ, ТМС) было сопряжено с определенными трудностями, более выраженными у адъюванта Фрейнда: плохое смешивание антигена с масляной эмульсией, образование пены при смешивании и в связи с этим потеря некоторого количества антигена, оседающего на стенках инъектора и пробирок для смешивания; образование гранулем у биомоделей на месте введения препаратов, а также угнетение общего состояния здоровья лабораторных животных. Применение водорастворимого иммуномодулятора ПО позволяло избежать описанных негативных моментов и побочных эффектов.

Таким образом, в наших экспериментах ПО продемонстрировал высокую эффективность в качестве адъюванта при иммунизации BALB/c мышей рекомбинатными и химически очищенными антигенами бактериальной природы.

Выводы

1. Применение ПО позволяет получить в короткие сроки высокие титры специфических антител, и по этому показателю превосходит классические адъюванты на основе масел - ПАФ и TMC.
2. ПО легко смешивается с растворами антигенов и не вызывает побочных сайд-эффектов у биомоделей.
3. Перспективным является дальнейшее изучение влияния ПО на изменения иммунного ответа у иммунизируемых биомоделей и определение возможности его использования для создания высокоэффективных субъединичных вакцин против заболеваний, вызываемых внутриклеточными бактериями, в частности патогенными иерсиниями и хламидиями.

Работа выполнена при частичной поддержке грантов NIH/BTEP/ISTC Проект #3846 и HDTRA 1-11-1-0032, Subaward No. 11-082.

Рецензенты:

• Назарова Л.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», г. Саратов.
• Шульдяков А.А., д.м.н., профессор, зав. кафедрой инфекционных болезней ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России, г. Саратов.

Библиографическая ссылка