Сетевое научное издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,936

Введение. Дисплазия тазобедренного сустава является одним из наиболее распространенных врожденных состояний опорно-двигательного аппарата. Это дегенеративно-диспластическое заболевание, характеризующееся дезорганизацией структурных элементов хрящевой ткани суставной поверхности тазобедренного сустава, меняющееся во времени с возрастом, что и определяет развитие дегенеративных суставных изменений в детском, подростковом и более старшем возрасте [1].

В соответствии с общепринятой классификацией, наиболее тяжелым состоянием диспластичного сустава является врожденный вывих бедра [2]. Несмотря на то, что существует множество теорий патогенеза дисплазии тазобедренного сустава (врожденного вывиха бедра), вопросы этиологии остаются открытыми [3]. Ранняя диагностика и лечение дисплазии тазобедренного сустава (врожденного вывиха бедра) имеют решающее значение в состоянии сустава и качестве жизни детей [4]. Общепринятые методики консервативного и хирургического лечения детей (подростков) отражены в стандартах лечения и клинических рекомендациях [5]. Изучение клинического материала пациентов с врожденным вывихом бедра – биоптата суставной ткани головки бедренной кости позволит проанализировать структурные компоненты хряща, являющиеся морфологическим субстратом исследуемого заболевания.

Структурная организация внеклеточного матрикса и клеточных элементов хряща обеспечивает физиологическое функционирование хрящевой ткани. Клеточная пролиферация и архитектура тканей – одни из основных показателей гомеостаза. Межклеточные взаимодействия контролируют тканевое постоянство и ремоделирование внеклеточного матрикса (ВКМ) [6]. ВКМ обеспечивает структурную поддержку и создает динамичную среду для клеток и сигнальных молекул. Матриксные металлопротеиназы (ММР) – это регуляторные протеазы, участвующие в синтезе, деградации и ремоделировании компонентов ВКМ, тем самым выполняющие важную роль в поддержании его структурной целостности [7]. Патофизиологические механизмы при дегенеративно-диспластических процессах опорно-двигательного аппарата – дисплазия тазобедренного сустава (врожденный вывих бедра) способствуют ремоделированию внеклеточного матрикса и экспрессии ММР [6; 8]. Суставной гиалиновый хрящ состоит из хондроцитов, хондробластов и внеклеточного матрикса, состоящего в свою очередь из двух основных компонентов: коллагеновые фибриллы II типа и протеогликаны-аггреканы [9]. Структурные клеточные элементы здорового хряща находятся в состоянии динамического равновесия с балансом между синтезом и деградацией коллагена и аггрекана. Этот баланс нарушается при дегенеративно-диспластическом процессе при исследуемом заболевании в пользу протеолиза, что приводит к патологическому разрушению хряща [10]. ММР, синтезируемые хондроцитами и синовиальными фибробластами, считаются основными ферментами, ответственными за эту деградацию [11]. Катаболические процессы, индуцируемые медиаторами воспаления, к которым относятся провоспалительные ММР, изучаются в настоящее время. Семейство ММР представляют собой кальций- и цинкзависимые эндопептидазы. ММР подразделяются на коллагеназы (ММР-1, -8, -13), желатиназы (желатиназа A (ММР-2) и желатиназа B (ММР-9)), стромелизины (ММР-3 и -10, -11), макрофагальную металлоэластазу (ММР-12), матрилизин (ММР-7) и ММР мембранного типа (МТ). Процесс протеолитической активации ММР3 (стромелизин) [12] и ММР9 (желатиназа В) [13] является одним из первичных факторов, индуцирующих восприимчивость хрящевого матрикса к инициаторам деградации, что приводит к утрате биомеханических связей матрикса хряща.

Цель исследования: изучить результаты иммуногистохимического выявления матриксных металлопротеиназ (ММР3 и ММР9) в различных зонах гиалинового хряща головки бедренной кости при врожденном вывихе бедра.

Материал и методы исследования. В период с февраля по ноябрь 2024 года в научно-исследовательском отделе детской вертебрологии и ортопедии был получен материал для морфологического исследования (вид операции – сочетанное вмешательство на бедренном компоненте в виде корригирующей (меж)подвертельной остеотомии и исправления положения головки бедренной кости); иммуногистохимическое исследование проведено в научно-исследовательском отделе организации научных исследований. Учреждение – ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России. Материал для морфологического исследования – образцы суставного хряща (участок гиалинового хряща включал поверхностную и промежуточную зоны) нагружаемой поверхности головки бедренной кости 5 пациентов (3 девочки и 2 мальчика). Средний возраст пациентов на момент забора операционного материала составил 3 года 8 мес. ± 1 год 2 мес. Критерии включения пациентов: подтвержденный основной диагноз – врожденный вывих бедра одно- и двусторонний (по МКБ-10: Q66.0 и Q65.1 – врожденный вывих бедра двусторонний). Критерии исключения: неврологическая патология, родовые травмы в анамнезе, аутоиммунная патология, инфекционные заболевания, наследственные метаболические и хромосомные болезни. Группа контроля не предполагалась. Тип дизайна – пилотное гипотезопорождающее исследование. Исследование основывалось на принципах неслучайной выборки – основной диагноз по МКБ-10. Дизайн исследования, включающий информированное согласие пациентов, одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «ННИИТО им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России (протокол № 005/23-1 от 16 февраля 2023 года). Материал для морфологического исследования – образцы суставного хряща - отмывали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS, MicroGen, Russia), фиксировали в растворе формалина 10% забуференного (BioVitrum, Russia). Проводили обезвоживание материала в спиртах возрастающей концентрации; просветление материала – толуол, 3-кратно; пропитывание материала – парафин/толуол (1:1), парафин («Гистомикс», Россия) 2-кратно, аппарат для гистологической обработки тканей (АГТ11-ФМП, Россия). Готовили полутонкие и тонкие срезы на микротоме (МС-2, Россия). Перед проведением иммуногистохимического окрашивания проводили депарафинизацию срезов, для подавления активности эндогенной пероксидазы применяли 3% перекись водорода. Инкубирование срезов в блокирующем буфере – 1%-ный бычий сывороточный альбумин (BSA, BioClot, Германия) в PBS проводили в течение 30 минут во влажной камере и преципитировали с первичными антителами: ММР3 (А22328, ABclonal, Китай; 1:100, моноклональные кроличьи), ММР9 (А11521, ABclonal, Китай; 1:100, моноклональные кроличьи) в течение 18 часов при температуре 4°C. Инкубирование со вторичными антителами, меченными пероксидазой, выполняли в течение 1,5 часов в темном месте при комнатной температуре. Для визуализации изучаемых ММР проводили окрашивание хромогенным красителем (G1212-200T, DAB, Servicebio, Китай). Парафиновые срезы препаратов для выявления расположения клеток и их ядер окрашивали гематоксилином и эозином. Оптическую оценку иммуногистохимически окрашенных срезов проводили на модульном микроскопе Olympus CX43 (Olympus, США). Количественную оценку иммуноокрашенных ММР3 и ММР9 проводили в 10 оптических полях каждого образца; единица исследования – структурный элемент (с.э.). Для определения зонального местоположения изучаемых ММР во ВКМ основывались на морфологических особенностях хрящевых клеток, которые для каждой зоны хряща имеют особенности размера, формы и ориентации в пространстве. Единичные уплощенные относительно малого размера хондроциты, ориентированные вдоль поверхности хряща, характерны для поверхностной зоны. В промежуточной зоне расположены хондроциты большего размера, имеющие округлые очертания и расположенные в составе изогенных групп [14]. Статистическую обработку количественных показателей выполняли при помощи программы Microsoft Exсel (Microsoft, США). Тип распределения данных устанавливали при помощи параметрического теста Шапиро-Уилка. Определено нормальное распределение данных. Показатели представлены в виде значений среднего арифметического и стандартного отклонения. Для оценки межгрупповых значений средних величин применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В постнатальном периоде (раннее детство) гиалиновый хрящ суставной поверхности головки бедренной кости состоит преимущественно из хондробластов, созревающих хондроцитов и ВКМ. В исследуемых срезах препаратов биоптатов, полученных интраоперационно, были представлены две зоны – поверхностная и промежуточная. Поверхностная зона хряща имеет низкую плотность клеток, в интертерриториальном матриксе которой располагаются единичные, уплощенные хондроциты с эксцентрично расположенным круглым или овальным ядром и слабо базофильной цитоплазмой. Промежуточная зона включала в себя хондроциты, формирующие изогенные группы из 2-3 клеточных элементов, расположенные в лакуне, к стенке которой примыкает базофильно окрашенный территориальный матрикс с не резко выраженными границами. Хондроциты здесь имели средний размер и округлую форму. В них определялось крупное овальное ядро, окруженное базофильной цитоплазмой. В результате исследования выявлены с.э. ММР3 и ММР9 в ВКМ поверхностной и промежуточной зон суставного гиалинового хряща головки бедренной кости при врожденном вывихе бедра.

В поверхностной зоне суставного гиалинового хряща наблюдали положительную детекцию ММР3 (рис. 1а) в виде мелких округлых структурных элементов, расположенных диффузно в ВКМ и ММР9 (рис. 1б) в виде редко расположенных одиночных структур овальной формы. Выявленные структурные элементы располагались в ВКМ вблизи с хондроцитами.

Рис. 1. Поверхностная зона гиалинового хряща суставной поверхности головки бедренной кости пациента мужского пола, 2 года 8 мес. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ММР3 (а), ММР9 (б). Масштабный отрезок 50 мкм

В промежуточной зоне гиалинового хряща также наблюдали детектированные ММР3 (рис. 2а) и ММР9 (рис. 2б) в виде диффузно расположенных в ВКМ одиночных округлых образований.

Рис. 2. Промежуточная зона гиалинового хряща суставной поверхности головки бедренной кости пациента женского пола, 3 года. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ММР3 (а), ММР9 (б). Масштабный отрезок 40 мкм

Количественные результаты – цифровые показатели структурных элементов, выявленных ММР3 и ММР9 как внутри поверхностной, так и внутри промежуточной зоны, между собой значимо не отличались.

При сравнении количественных показателей с.э. ММР3 - округлых структур в ВКМ – в изучаемых зонах выявили, что в промежуточной зоне структурных элементов в 2 раза больше, чем в поверхностной зоне. Такую же закономерность в исследуемых зонах суставного гиалинового хряща наблюдали и при изучении с.э. ММР9 (табл.).

Количественный анализ структурных элементов ММР3 и ММР9 в зонах гиалинового хряща суставной поверхности головки бедренной кости при врожденном вывихе бедра

Определено статистически значимое увеличение количественных показателей с.э. ММР3 и ММР9 в промежуточной зоне хряща наряду с визуализацией пустых лакун, не содержащих хондроциты. Полученные данные могут свидетельствовать о формировании дистрофии в этой зоне, нарушении метаболических процессов в ВКМ хряща, дезорганизации клеточных структур, разрушении межклеточных взаимодействий и нарушении тканевого баланса. Положительная иммуногистохимическая детекция ММР3 и ММР9 может быть расценена как активация протеолитических механизмов, инициирующая дегенеративно-диспластический процесс, приводящий к дезорганизации клеточных структур гиалинового хряща – хондроцитов и интертерриториального матрикса, и изменении их синтетической активности.

Представленные в литературе данные сравнительных исследований структурно-функциональных характеристик суставного гиалинового хряща головки бедренной кости в норме и при выраженной степени дисплазии тазобедренного сустава (врожденном вывихе бедра) выявили различия в количестве и структуре хондроцитов [15]. Результаты гистоморфологического исследования суставного хряща головки бедренной кости при данной патологии характеризуются дистрофическими и дегенеративными изменениями поверхностной зоны, что проявляется в виде участков некроза, дегенерации матрикса, дезорганизации и уменьшении количества коллагеновых фибрилл, единично расположенных хондробластах [16]. Определены изменения в строении и расположении клеток в промежуточной зоне хряща, где выявляются участки бесклеточного матрикса, преобладание пустых лакун, общее снижение количества хондроцитов [17]. Положительная детекция ММР3 и ММР9 в суставной ткани тазобедренного сустава при врожденном вывихе бедра может быть одним из признаков проявления дегенеративно-дистрофического процесса [18].

Матриксные металлопротеиназы играют важную роль в деградации внеклеточного матрикса, дезорганизации структурных компонентов хрящевой ткани и прогрессировании дегенеративно-диспластического процесса [19]. Повышенная экспрессия ММР3 и ММР9 увеличивает скорость процесса деградации коллагена II типа [20].

Представленные данные дают основание предполагать, что протеолитическая активность матриксных металлопротеиназ (ММР3 и ММР9), возможно, является первичным универсальным ответом, создающим неустойчивость к ингибиторам разрушения суставного гиалинового хряща. Это приводит к нарушению способности хондроцитов образовывать молекулярно-биохимические связи с внеклеточным матриксом и формированию гистоморфологических признаков дегенеративно-дистрофического процесса при врожденном вывихе бедра.

Заключение. В результате проведенного исследования были выявлены ММР3 и ММР9 в обеих изучаемых зонах – поверхностной и промежуточной гиалинового хряща суставной поверхности головки бедренной кости при врожденном вывихе бедра. Определено значимое количественное увеличение структурных элементов ММР3 и ММР9 в глубине хряща, то есть в промежуточной зоне, по сравнению с поверхностной зоной хряща. Представленные данные, возможно, являются предикторами дегенеративно-диспластического процесса при врожденном вывихе бедра. Изучение структурных элементов ВКМ суставной ткани гиалинового хряща головки бедренной кости при исследуемом заболевании в дальнейшем позволит оценить гистоморфологические проявления патологического процесса.