Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Одним из часто встречающихся внекишечных проявлений воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК) является поражение опорно-двигательного аппарата, распространенность артропатий достигает 50% среди пациентов с ВЗК [1; 2]. Согласно современным представлениям, общими характеристиками для ВЗК и спондилоартритов (СпА) являются генетическая предрасположенность с чувствительностью к факторам окружающей среды (курение, стрессы, инфекции) и дефекты иммунной регуляции, приводящие к аутоиммунным и аутовоспалительным реакциям. Помимо иммуногенетического маркера высокой предрасположенности к СпА – человеческого лейкоцитарного антигена HLA B27 (Human leukocytic antigen B27), полногеномные ассоциативные исследования (genome-wide association study, GWAS) выявили полиморфизмы в интерлейкине-23R (ИЛ-23R), ИЛ-12, STAT3, PTGER4, ИЛ-6R, ИЛ-10 и CARD9 [3]. Изучение механизмов, лежащих в основе иммунной регуляции и разрешения воспаления, представляет большой интерес для лучшего понимания патофизиологии внекишечных проявлений ВЗК и разработки новых подходов к терапии [4]. При обсуждении реализации механизмов врожденного и приобретенного иммунитета первоочередное значение уделяется провоспалительным цитокинам – фактору некроза опухоли α (ФНО–α), интерлейкинам (ИЛ-1β, ИЛ-6 и т.д.), что привело к созданию генно-инженерных биологических препаратов, применяемых для лечения ВЗК и СпА. Увеличение концентрации провоспалительных цитокинов при ВЗК и СпА является в том числе результатом запуска сигнальных путей нейтрофилов. Активность нейтрофилов реализуется посредством фагоцитоза с образованием активных форм кислорода (АФК) и нетоза - образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (NETs). Роль противовоспалительных цитокинов в регуляции и разрешении воспаления при различных аутоиммунных и аутовоспалительных заболеваниях и их возможный терапевтический потенциал требуют уточнения.

Цель исследования – оценить возможные связи между показателями функциональной активности нейтрофилов и уровнями ФНО-α, пептидил-аргинин деиминазы 4 типа (PAD-4), ИЛ-10, ИЛ-17А, ИЛ-23 у пациентов с ВЗК и внекишечным проявлением в виде суставного синдрома.

Материал и методы исследования. Дизайн – одномоментное исследование. В исследование включены пациенты, обратившиеся в гастроэнтерологический кабинет и находившиеся на стационарном лечении ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница» в период с декабря 2019 года по январь 2021 года. Все пациенты подписали информированное согласие, одобренное этическим комитетом ФГБОУ ВО «ЮУГМУ» МЗ РФ (протокол №10 от 15.11.2019). Критерии включения: установленный диагноз язвенный колит (ЯК) или болезнь Крона (БК), возраст старше 18 лет, согласие пациента на участие в исследовании. Критерии исключения: наличие острых инфекционных заболеваний, онкологические заболевания с активностью процесса в течение последних пяти лет, беременные. Диагноз ЯК и БК устанавливался в соответствии с актуальными национальными клиническими рекомендациями [5; 6]. Выявление артропатий и наличия воспалительной боли в спине проводилось согласно критериям ASAS (The Assessment of SpondyloArthritis international Society, 2009), клинико-лабораторное и инструментальное обследования - согласно клиническим рекомендациям [7].

Для иммунологического исследования использовали венозную кровь, которую забирали в вакуумную пробирку с литий-гепарином объемом 6 мл. Исследование субпопуляционного спектра лейкоцитов крови проводили методом проточной цитометрии на проточном цитометре Navios 6/2 (Beckman Coulter, США). Для фенотипирования и дифференцировки субпопуляций нейтрофилов использовали конъюгаты моноклональных антител: CD3, PE-eFluor 610 (eBioscience, США); CD19, PE (eBioscience, США); CD56, PE (eBioscience, США); CD4, APC (eBioscience, США); CD8, PE-Cy5.5 (Invitrogen, США); CD25, PE-Cy7 (eBioscience, США); CD127, FITC (eBioscience, США).

Функциональную активность нейтрофилов периферической крови исследовали по показателям поглотительной способности частиц монодисперсного полистирольного латекса (активность, интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число), показателям кислородзависимого метаболизма в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ): активности и интенсивности спонтанного и индуцированного НСТ-теста. Лизосомальную активность определяли по интенсивности люминесценции лизосом, обработанных акридиновым оранжевым [8].

Концентрацию PAD4 в сыворотке оценивали метода ELISA c использованием наборов производства Wuhan Fine Biotech Co., Ltd (КНР). Концентрацию ФНО-α, ИЛ-10 в сыворотке оценивали методом ELISA c использованием тест-системы «Вектор-Бест» (Россия). Концентрацию ИЛ-17А, ИЛ-23 в сыворотке оценивали методом ELISA c использованием тест-системы Cloud-Clone Corp. (КНР). Исследование уровня цитокинов и PAD4 проводили на иммуноферментном анализаторе ADALTIS Personal LAB (Италия).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета статистического анализа данных IBM SPSS v.19 и MedCalc v.20.218. Качественные переменные описывали абсолютными и относительными частотами (процентами). Количественные переменные описывали медианой (Ме) c указанием интерквартильного интервала [25-й процентиль; 75-й процентиль]. В целях определения взаимосвязей показателей использовали корреляционный анализ Спирмена. Для оценки значимости различий между двумя группами использовали критерий Манна-Уитни. Для сравнения качественных данных использовался критерий χ2 Пирсона. При сравнении трёх групп использовали критерий Краскела-Уоллиса с последующим апостериорным сравнением критерием Данна с поправкой уровня значимости по Бонферрони. Диагностическую значимость количественных признаков определяли ROC-анализом. Различия считали статистически значимыми при критическом уровне значимости 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В исследование были включены 97 пациентов. Характеристика пациентов представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика больных с воспалительными заболеваниями кишечника

Примечания: БК – болезнь Крона, ЯК – язвенный колит, ЖКТ – желудочно-кишечный тракт.

Comments: IBD = inflammatory bowel disease; CD = Crohn’s disease; UC = ulcerative colitis; LQ = lower quartile; UQ = upper quartile.

При оценке гендерного состава среди пациентов с болезнью Крона мужчины встречались реже, в то время как сравнительная оценка тяжести течения ВЗК достоверных различий между группами не выявила.

Среди пациентов с жалобами на боли в суставах остеоартрит диагностирован у 37 (38,1%) пациентов, периферический артрит у 47 (48,5%) пациентов. У 13 (13,4%) пациентов не выявлено объективных признаков воспаления, нарушения функции суставов, установлена артралгия и рекомендовано динамическое наблюдение. Проведенный анализ позволил установить статистически значимые различия возраста пациентов с определенной артропатией (p<0,0001). Апостериорные сравнения показали, что по возрасту пациенты с остеоартритом были статистически значимо старше пациентов с периферическим артритом (p<0,016). На рисунке 1 представлены значения возраста пациентов с ВЗК с суставным синдромом.

Рис. 1. Возраст пациентов с артропатиями при воспалительных заболеваниях кишечника

Оценка уровня цитокинов, PAD4, функциональной активности нейтрофилов и субпопуляционного состава лейкоцитов представлена в таблице 2.

Таблица 2

Показатели гуморальных и клеточных факторов иммунитета у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника и жалобами на боли в суставах

Концентрация ИЛ-10 в сыворотке крови значимо не различалась у пациентов с различными вариантами поражения суставов. Однако среди пациентов с вовлечением более трех суставов были выявлены статистически значимо меньшие значения концентрации сывороточного ИЛ-10 (рис. 2).

Рис. 2. Концентрация ИЛ-10 в сыворотке крови у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника в зависимости от наличия полиартрита

С целью изучения потенциальной диагностической эффективности сывороточной концентрации ИЛ-10 в отношении выявления полиартрита у пациентов с ВЗК был проведен ROC-анализ, результаты которого представлены на рисунке 3.

Рис. 3. ROC-кривая диагностической эффективности показателя ИЛ-10 при наличии полиартрита у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника

Пороговое значение ИЛ-10 ≤2,714 пг/мл позволяло диагностировать полиартрит с чувствительностью 61,1% и специфичностью 70,4% (индекс Юдена 0.3153; PPV 34,4; NPV 87,7). По данным логистического регрессионного анализа, снижение ИЛ-10 ≤2,714 пг/мл ассоциировалось с ОШ наличия полиартрита 3,903 (95% ДИ 1,306-11,664; p=0,0148) независимо от пола, возраста и варианта ВЗК (ЯК или БК).

Распространенность артрита снижается с возрастом у пациентов с ВЗК, что не противоречит полученным данным, где пациенты с периферическим артритом были значимо младше [1]. Если говорить о роли участия врожденного иммунитета в патогенезе спондилоартритов, то в настоящее время нейтрофилы и NETs являются ключевыми источниками IL-1β и IL-17, играющими важную роль в хронизации воспаления и остеогенезе при АС [9]. РНК-секвенирование на модели экспериментального спондилоартрита показало, что гены, связанные с функцией нейтрофилов и образованием NETs, были одними из самых активированных [10]. Кроме того, нейтрофилы были идентифицированы как тип клеток с наибольшей экспрессией IL-17 в биоптатах апофизарных суставов больных АС. В то же время модели на животных продемонстрировали, что IL-1β может активировать остеокласты, резорбирующие кость, и индуцировать разрушение суставов, в то время как повышенная экспрессия IL-1β была обнаружена в синовиальной оболочке пациентов со спондилоартритом [9]. В проведенном исследовании не было выявлено взаимосвязей между PAD4 и показателями кислородзависимого метаболизма нейтрофилов. Можно предположить, что нейтрофилы и NETs участвуют в активации других иммунных и структурных клеток, повышая выработку провоспалительных цитокинов и усиливая воспаление не только в кишечнике, но и в периферических суставах. Провоспалительные цитокины, в свою очередь, могут индуцировать высокие уровни маркеров окислительного стресса, что может быть связано с высвобождением NETs. Таким образом, в воспалительном ответе при артрите у пациентов с ВЗК могут участвовать оба пути – высвобождение NET и секреция провоспалительных цитокинов нейтрофилами, которые по принципу положительной обратной связи вызывают высвобождение NETs.

Роль ИЛ-10 в патогенезе ВЗК убедительно доказана. В настоящем исследовании выявлено снижение концентрации ИЛ-10 в крови у пациентов с вовлечением более 3 суставов в артропатии при ВЗК. Получены данные о корреляции полиморфизмов ИЛ-10, ИЛ-10Rα и ИЛ-10Rβ с ранним началом колита у пациентов. GWAS дополнительно выявили важную роль оси ИЛ-10 в развитии ВЗК как у мышей, так и у людей [11; 12]. Сходным образом ИЛ-10 способствует ослаблению экспериментального артрита, предположительно, влияя на баланс между клетками Th-17 и Treg-клетками [13]. ИЛ-10 является мощным иммуномодулирующим цитокином, концентрация которого повышена как в сыворотке, так и в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом. In vitro нейтрализация ИЛ-10 в культурах синовиальных мембран при РА приводила к увеличению экспрессии ФНО-α и ИЛ-1β [14].

Переход синовиальных макрофагов между провоспалительным и противовоспалительным фенотипом может играть ключевую роль в построении внутрисуставного микроокружения. Провоспалительный каскад, индуцируемый ФНО-α, ИЛ-1β и ИЛ-6, тесно связан с макрофагами фенотипа M1, что приводит к продукции прохондролитических медиаторов. Однако ИЛ-10, хемокин CCL-18, инсулиноподобный фактор роста (IGF) и трансформирующий фактор роста (TGF) тесно связаны с макрофагами M2, что приводит к защите хряща и ускорению регенерации. Исследования показывают, что остеоартрит в основном возникает в результате активации врожденного иммунного ответа, индуцированного макрофагами, значительную долю которых составляет фенотип M1. Показано, что ИЛ-10 подавляет инфильтрацию и активацию нейтрофилов в синовиальной оболочке благодаря переходу в сторону М2. У пациентов с остеоартритом ИЛ-10 уменьшает количество специфических рецепторов для ФНО-α и влияние ФНО-α на фибробласты путем подавления PEG2, COX2 и PLA2 и, модулируя пути митохондриального апоптоза, может ингибировать апоптоз хондроцитов [15].

В настоящей работе на основании регрессионного анализа установлено, что уровень ИЛ-10, независимо от пола, возраста и варианта ВЗК, является фактором, ассоциированным с полиартритом любой этиологии. Количественная оценка ИЛ-10 имеет потенциал в качестве вспомогательного сывороточного маркера для быстрой и доступной диагностики артропатий у пациентов с ВЗК.

Основным ограничением настоящего исследования был небольшой размер выборки, что требует дальнейших исследований с большим числом пациентов.

Заключение. Пациенты с ВЗК и периферическим артритом были более молодого возраста. Снижение концентрации ИЛ-10 ≤2,714 пг/мл позволяло диагностировать полиартрит с чувствительностью 61,1% и специфичностью 70,4%.