Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Одну из наиболее социально и экономически значимых проблем современной медицины составляют ожоги в связи с тенденцией к увеличению частоты и тяжести термической травмы, многофакторностью ее патогенеза, сложностью, длительностью лечения и высоким процентом инвалидизации и смертности. Повреждение тканей при тяжелой термической травме приводит к увеличению образования активных форм кислорода (АФК), гипоксии и истощению антиоксидантной защиты, развитию системного воспалительного ответа, эндотелиальной дисфункции, полиорганной недостаточности [1, 2]. Вследствие роста АФК возникает окислительный стресс, а в случае преобладания восстановителей и антиоксидантов или блокировки электрон-транспортной цепи развивается восстановительный стресс. Избыточные восстановители реоксигенируются в митохондриях, что приводит к взрыву генерации АФК [3, 4]. Однако механизм усиления продукции О2− в дыхательной цепи митохондрий при термической травме практически не изучен. При этом оценка активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) наряду с определением каталитических свойств лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в митохондриях печени при термической травме может служить одним из критериев степени выраженности гипоксии, так как СДГ в значительной мере определяет скорость потребления кислорода и образования АТФ в дыхательной цепи. Посредством повышения генерации АФК восстановительный стресс, как и окислительный, инициирует рост активности свободнорадикального окисления (СРО). Одной из характеристик окислительного стресса является повышенное образование и накопление продуктов перекисного окисления клеточных компонентов. Наибольшее внимание исследователей привлекают продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), поскольку они способны к продолжению цепи повреждения компонентов клетки. Таким образом, исследование структурно-функциональных особенностей митохондрий при ожоговой болезни позволит расширить представления о возникновении и развитии метаболических нарушений в гепатоцитах, приводящих к гипоксии и окислительному стрессу.

Целью исследования было изучение структурных особенностей и окислительно-энергетического статуса печени при экспериментальном ожоге.

Материал и методы исследования. Работа выполнена на 30 крысах-самцах линии Wistar массой 200–250 г в условиях термической травмы. Эксперимент проводили в строгом соответствии с этическими нормами и правилами лабораторной практики (GLP), Женевской конвенции по защите животных «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990), приказом МЗ РФ № 708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и с одобрения Локального этического комитета ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России.

Животные содержались в стандартных условиях вивария: при естественном освещении, сбалансированном рационе питания и свободном питьевом режиме. Животные были рандомно разделены на 2 группы: 1-я – контрольная – интактные здоровые крысы (n=15); 2-я – опытная – крысы с комбинированной термической травмой (КТТ) (n=15). Экспериментальную комбинированную термическую травму моделировали под внутримышечным наркозом (Zoletil 100 (VIRBAC, France) (60 мг/кг) + Xyla VET (Pharmamagist Ltd., Hungary) (6 мг/кг) путем нанесения контактного ожога на площадь 20% поверхности тела и термоингаляционного воздействия горячим воздухом и продуктами горения [5]. Крыс выводили из эксперимента на 1-е, 7-е, 14-е сутки после КТТ декапитацией под наркозом (Zoletil 100 + Xyla VET) (рис. 1).

Рис. 1. Схема эксперимента

Митохондрии выделяли путем дифференциального центрифугирования из гомогената печени. Состав раствора для получения гомогената печени включал 0,25 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 0,01 М трис-HCl-буфер (рН = 7,5) [6]. Электронно-микроскопическое исследование качества и структурного состава митохондрий проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа HT7700 (Hitachi). Для этого полученную фракцию митохондрий погружали в 2,5% глутаровый альдегид с последующей дофиксацией четырехокисью осмия. После промывки буферным раствором, проводки по спиртам восходящей крепости и пропитки материал заключали в эпоксидную смолу. Приготовление срезов толщиной 100 нм осуществляли с помощью ультрамикротома Power Tome PC (RMC Products, США). Для контрастирования ультратонких срезов использовали уранилацетат и цитрат свинца.

Для оценки энергетического метаболизма и наличия признаков гипоксии при КТТ в гомогенате и митохондриях печени определяли каталитические свойства лактатдегидрогеназы в прямой реакции (ЛДГпр) и обратной реакции (ЛДГобр) [5], в митохондриях – удельную активность ферментов дыхательной цепи – СДГ и цитохром с-оксидазы [7]. В гомогенате и митохондриях печени оценивали интенсивность СРО по концентрации диеновых конъюгатов (ДК), триеновых конъюгатов (ТК) и оснований Шиффа (ОШ) [8], удельную активность антиоксидантных ферментов – каталазы [5] и супероксиддисмутазы (СОД) [9]. Для расчета удельной активности ферментов определяли содержание белка в гомогенате и митохондриальной фракции печени [10].

Для статистической обработки результатов использовали программу Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Результаты представлены в виде средней арифметической величины показателей и среднего квадратичного отклонения. Для оценки нормальности распределения полученных данных применяли критерий Шапиро–Уилка, для установления значимости различий – t-критерий Стьюдента, для выявления взаимосвязей между показателями – коэффициент корреляции (r) Пирсона.

Результаты исследования и их обсуждение. Проведенная оценка полученной фракции митохондрий показала, что образцы соответствовали требованиям к материалу для электронно-микроскопических фотографий высокого качества и информативности и главное – были пригодны для дальнейшей оценки метаболических изменений указанными выше методами. Органеллы хорошо идентифицировались, мембраны митохондрий из печени крыс контрольной группы были сохранны, матрикс – плотный, кристы преимущественно четкие (рис. 2 А,а). Выявлены отличия от контроля в структуре элементов митохондриальной фракции, выделенной из печени крыс после КТТ: через 7 суток после ожога в образцах обнаруживались как крупные, так и мелкие митохондрии, мембраны большей части органелл были сохранены, кристы частично просматривались, однако была отмечена выраженная дистрофия части митохондрий в полях зрения (рис. 2 Б,б). Через 14 суток после КТТ в образцах в большом количестве визуализировались митохондрии, охарактеризованные как «набухшие», с признаками значительных изменений внутренней структуры. В некоторых органеллах отмечались нарушение длины, формы крист, их разрывы и даже полное отсутствие крист, а также встречались отдельные полностью разрушенные органеллы (рис. 2 В,в). Часть митохондрий, напротив, имела плотный гранулярный матрикс, маскирующий кристы. Кроме того, на этом сроке эксперимента в образцах митохондрий из печени животных опытной группы, как в самих органеллах, так и на поверхности их мембран, были обнаружены уплотнения, предположительно – зерна гликогена, рибосомы [5].

Исследование активности ферментов дыхательной цепи митохондрий выявило статистически значимое ингибирование СДГ (рис. 3а) и цитохром с-оксидазы (рис. 3б) после КТТ по сравнению с показателями здоровых крыс. Снижение удельной активности СДГ на 1-е (в 1,1 раза (p=0,016)), 7-е (в 2,6 раза (p=0,017)), 14-е сутки (в 10,2 раза (p=0,008)) после ожога и, соответственно, уменьшение активности цикла лимонной кислоты может быть вызвано активацией фумаратредуктазной реакции и, как следствие, увеличением АФК, ингибирующим СДГ [11]. Статистически значимое снижение удельной активности цитохром с-оксидазы в митохондриях печени крыс, получивших термический ожог, вероятно, обусловлено конформационными изменениями молекулы фермента под влиянием АФК, способных связываться с атомами металлов, входящих в его состав [12]. При этом уменьшение активности ферментов дыхательной цепи митохондрий при КТТ приводит к снижению в клетке аэробного и усилению анаэробного окисления. Кроме того, ингибирование СДГ и цитохром с-оксидазы может быть следствием нарушения работы электронного транспорта в мембране митохондрий и недостаточного производства АТФ, что вызывает уменьшение энергетического обеспечения клетки при ожоге.

А Б В

а б в

Рис. 2. Митохондрии печени крысы, сделанные с помощью трансмиссионного электронного микроскопа HT7700 (Hitachi): А,а) контрольная группа, увеличение x10000; Б,б) опытная группа, 7 суток после травмы, увеличение x10000; В,в) опытная группа, 14 суток после травмы, увеличение x20000, x30000 соответственно

О снижении энергетического метаболизма в печени после КТТ свидетельствовало ингибирование удельной активности ЛДГ как в прямой (рис. 3в), так и в обратной реакциях (рис. 3г), вызывая накопление лактата – маркера тканевой гипоксии. При экспериментальном ожоге в гомогенате печени удельная активность ЛДГпр уменьшилась в 1-е сутки в 3,2 раза (р<0,001), на 7-е сутки – в 2,3 раза (р<0,001), на 14-е сутки – в 1,9 раза (р=0,010); для ЛДГобр отмечено снижение удельной активности на 1-е сутки в 1,3 раза (р=0,027), на 7-е сутки – в 1,2 раза (р=0,031), на 14-е сутки – в 1,1 раза (р=0,039). В митохондриальной фракции выявлено ингибирование ЛДГпр и ЛДГобр при КТТ на 1-е сутки – в 2,4 раза (р<0,001) и 1,5 раза (р=0,026), на 7-е сутки – в 2,1 раза (р<0,001) и 1,4 раза (р=0,034), на 14-е сутки – в 1,9 раза (р=0,007) и 1,3 раза (р=0,038) соответственно по сравнению с контролем.

а б

в г

Рис. 3. Активность в митохондриях печени крыс в эксперименте с комбинированной термической травмой: а) сукцинатдегидрогеназы; б) цитохром с-оксидазы; в) ЛДГпр; г) ЛДГобр. * – различия между группами «опыт» и «контроль» значимы (p<0,05)

Накопление молочной кислоты при экспериментальном ожоге может быть обусловлено также ингибированием пируватдегидрогеназы и пируваткарбоксилазы и гипоксией индуцибельным фактором 1 (HIF-1), вызывающим активацию ЛДГобр [13]. Критическое снижение напряжения кислорода в ткани при термической травме наряду с ингибированием СДГ, цитохром с-оксидазы, ЛДГ приводит к активации анаэробного пути образования энергии в клетке.

Оценка концентрации первичных (ДК) и вторичных (ТК) продуктов ПОЛ в гомогенате и митохондриях печени выявила их наибольший рост на 7-е и 14-е сутки после КТТ, что вызвало интенсификацию СРО в печени крыс. На 1-е сутки после КТТ отмечено увеличение уровня ДК в гомогенате печени в 1,1 раза (р=0,041) и ТК – в митохондриях печени в 1,2 раза (р=0,035). При КТТ содержание ДК возросло в гомогенате на 7-е сутки в 1,6 раза (р=0,020) и на 14-е сутки – в 1,6 раза (р=0,005). Уровень ТК увеличился в гомогенате печени на 7-е сутки после КТТ в 1,7 раза (р=0,001), на 14-е сутки – в 2 раза (р=0,001), в митохондриях повысился на 7-е сутки после КТТ в 1,9 раза (р=0,007), на 14-е сутки – в 2,7 раза (р<0,001) по сравнению с контролем (табл. 1).

Содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов (ОШ) в печени возросло на 7-е и 14-е сутки после экспериментального ожога. Так, в гомогенате концентрация ОШ увеличилась на 7-е сутки после поражения в 1,2 раза (р=0,034), на 14-е сутки – в 2,8 раза (р=0,001) по сравнению с контролем. В митохондриях печени как показателе интегрального состояния клеток и источнике АФК отмечен рост уровня ОШ на 7-е сутки после травмы в 1,6 раза (р=0,003) и 14-е сутки – в 2,8 раза (р<0,001) (табл. 1). Рост высокотоксичных первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ при КТТ приводит к дестабилизации мембран и деградации клеток, что обусловлено способностью ДК, ТК и ОШ повреждать белки, липопротеиды и нуклеиновые кислоты.

Таблица 1

Интенсивность свободнорадикального окисления в печени крыс с комбинированной термической травмой

* – различия между группами «опыт» и «контроль» значимы (p<0,05).

При исследовании ферментативного звена антиоксидантной системы (АОС) печени на фоне КТТ выявлено статистически значимое уменьшение удельной активности каталазы в гомогенате и митохондриях на 1-е, 7-е, 14-е сутки по сравнению с контролем (рис. 4а), что подтверждает данные литературы об ингибировании АОС при ожоге на фоне усиления процессов СРО липидов и белков [14], что может привести к повреждению ткани печени.

Активность СОД снизилась в гомогенате печени в 1,9 раза (р=0,014) на 1-е сутки после КТТ, в 1,7 раза (р=0,022) – на 7-е сутки, в 1,2 раза (р=0,036) – на 14-е сутки (рис. 4б). В митохондриях на фоне КТТ при росте удельной активности СОД в 1,1 раза (p=0,037) на 1-е сутки после экспериментального ожога отмечено уменьшение каталитических свойств фермента к 7-м и 14-м суткам в 1,8 раза (p=0,036 и p=0,041 соответственно). Следовательно, при КТТ в гомогенате и митохондриях печени, вероятно, имеет место субстратное ингибирование СОД вследствие активации СРО (рост концентрации ДК, ТК, ОШ), приводящей к повышению количество АФК, в частности супероксидного радикала.

а б

Рис. 4. Активность в печени крыс с комбинированной термической травмой:

а) каталазы; б) супероксиддисмутазы. * – различия между группами «опыт» и «контроль» значимы (p<0,05)

Проведенный корреляционный анализ выявил наличие взаимосвязей между показателями окислительного и энергетического метаболизма в печени крыс с КТТ. В гомогенате печени на 1-е сутки после КТТ отмечена отрицательная корреляция между ДК и ЛДГпр (r=–0,734, p=0,006), на 7-е сутки – между ДК и ЛДГпр (r=–0,782, p=0,001), ОШ и ЛДГпр (r=–0,805, p=0,001), на 14-е сутки – между ОШ и ЛДГпр (r=–0,755, p=0,005), позволяющая заключить, что активация СРО обусловлена снижением энергетического метаболизма, и отрицательная корреляция на 7-е сутки после КТТ между ДК и СОД (r=–0,793, p=0,001), ДК и каталазой (r=–0,825, p=0,001), на 14-е сутки после КТТ – между ДК и СОД (r=–0,736, p=0,004), ОШ и СОД (r=–0,778, p=0,001), свидетельствующая о развитии окислительного стресса. Анализ взаимосвязей биохимических показателей в митохондриях печени выявил положительную корреляцию между активностью СДГ и цитохром с-оксидазы на 1-е (r=0,738, p=0,019), 7 (r=0,664, p=0,038) сутки, но отрицательную корреляцию между ОШ и ЛДГпр на 7-е (r=–0,812, p=0,001) и 14-е (r=–0,794, p=0,001) сутки после КТТ.

Таким образом, при КТТ вследствие чрезмерной продукции АФК и негативного ответа (снижение активности) ферментативного звена АОС развивается окислительный стресс, проявляющийся в повышении СРО и приводящий к усилению деструктивных процессов, повреждению мембран клеток и развитию системных нарушений [15], являясь патогенетическим фактором ожоговой болезни. При гипоксии, вызванной КТТ, в клетке активируется анаэробный гликолиз, накапливается лактат, развиваются ацидоз и энергетическая недостаточность. Одну из ключевых ролей в развитии окислительного стресса при гипоксии можно отвести митохондриям, в которых при комбинированной термической травме развиваются структурно-функциональные нарушения (рис. 5).

Рис. 5. Участие митохондрий в развитии метаболических нарушений гепатоцитов при комбинированной термической травме

Заключение. В ходе проведенного исследования доказано наличие при комбинированной термической травме в организме, во-первых, гипоксии и, во-вторых, окислительного стресса. Выявлены изменения в структуре элементов митохондриальной фракции, выделенной из печени крыс после КТТ, и угнетение энергетического обеспечения митохондрий при ожоге, проявляющееся уменьшением активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром с-оксидазы, что свидетельствует о снижении в клетке аэробного и усилении анаэробного окисления. В проведенном исследовании показано, что определение активности антиоксидантных ферментов, а также сукцинатдегидрогеназы и цитохром с-оксидазы может быть использовано в качестве маркеров метаболических нарушений печени при гипоксии, обусловленной термической травмой.

Авторы выражают глубокую признательность руководителю лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. проф. И.Н. Блохиной доктору биологических наук, профессору Новиковой Надежде Алексеевне за предоставленный доступ к оборудованию и благодарность научному сотруднику Александру Юрьевичу Кашникову за проведенные исследования.

Авторы выражают благодарность Центру корреляционной микроскопии ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России за подготовку научной иллюстрации.