Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Гормоны щитовидной железы трийодтиронин (Т3) и тетрайодтиронин, или тироксин (Т4), с тремя и четырьмя атомами йода в молекуле, образуются в фолликулах из моно- и дийодтирозинов, при их конденсации являются биологически активными веществами, участвуют в регуляции многих процессов. Основным по количеству в крови является тироксин, но активность последнего в 10 раз больше [1, с. 1250].

Тиреоидные гормоны воздействуют практически на весь организм, что проявляется увеличением скорости основного обмена и процессов метаболизма, усилением синтеза белков, влиянием на метаболизм углеводов и жиров, регуляцией роста костей, хрящей и созреванием нервной системы, повышением чувствительности тканей к катехоламинам, влиянием на артериальное давление, частоту и силу сердечных сокращений, двигательную активность, температуру тела, правильное развитие и дифференцировку клеток и многое другое [2, с. 1046-1049]. Но в то же время большое разнообразие действий гормонов щитовидной железы сопровождается частым развитием заболеваний. По данным ВОЗ, среди эндокринных нарушений болезни щитовидной железы по распространению находятся на втором месте после сахарного диабета.

С учётом того что йодсодержащие гормоны оказывают первостепенное влияние на основной обмен, что напрямую связано с количеством и состоянием митохондрий и течением аэробных процессов, а почки относятся к аэробным органам, нас заинтересовал вопрос об их влиянии на функции почек.

Цель исследования: создать на крысах экспериментальный гипертиреоз и изучить его влияние на водо- и ионовыделительную функции почек, и при выявлении изменений вскрыть механизмы, лежащие в их основе.

Материалы и методы исследования. Опыты были поставлены на 44 крысах линии Wistar массой 170-230г (194±16г) и примерно одного возраста (5-7 месяцев). Сначала на всех крысах провели контрольные исследования, для этого их помещали на шесть часов в специальные мочеприемники, где вся выделяющаяся моча в чистом виде собиралась в стаканчик (каловые массы не попадали). В собранной моче спектрофотометрически (UNICO 2800, США) определяли содержание эндогенного креатинина (метод Поппера) и общего белка (метод Лоури), натрия и калия – методом пламенной фотометрии (ПФА-378, Россия). Затем в состоянии сна, вызванного в/б введением комплексного анестетика телазола (Zoetis, США), состоящего из тилетамина гидрохлорида (анестетик диссоциативного действия, оказывающий выраженное болеутоляющее действие) и золазепама гидрохлорида (транквилизатор, вызывающий анксиолитическое действие и расслабление скелетной мускулатуры, одновременно усиливает действие тилетамина), растворённого согласно инструкции в 5,0 мл воде для инъекций, и тогда в 0,1 мл доза телазола будет равна 2,0 мг, которую в среднем рекомендует изготовитель, инвазивным способом у 10 крыс с помощью ультразвукового флуометра (Transonic НТ 313, США) определили скорость почечного кровотока, после чего взяли у них кровь и почки. В плазме крови спектрофотометрически определяли содержание креатинина и общего белка (биуретовый метод), пламенной фотометрией – натрия и калия, концентрации свободных Т3 и Т4 – с помощью иммуноферментных наборов фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Определение общих Т3 и Т4 не имеет прогностического значения, так как они почти полностью (99,9%) связаны с белками и не обладают биологической активностью, а их содержание зависит не столько от истинной концентрации, сколько от уровня белков-транспортёров [3, с. 991]. Также в плазме крови определяли содержание гидроперекисей и малонового диальдегида в гемолизате мембран эритроцитов, активность ферментов антиоксидантной защиты – каталазы и супероксиддисмутазы [4, с. 207]. Изъятые почки разделяли послойно (корковое и мозговое вещества, почечный сосочек) и определяли в них содержание осмотически активных веществ – мочевины (спектрофотометрически тиосемикарбазидный метод) и натрия (методом пламенной фотометрии), а также процентное содержание воды.

Затем на оставшихся 34 крысах начали создавать модель гипертиреоза, вводя им в течение двух недель левотироксин натрия (промышленный синтетический левовращающий изомер тироксина или L-тироксин, входит в список основных лекарственных средств ВОЗ) [5, с. 41]. Доза вводимого препарата была 5,0 мкг/100г [6, с. 45; 7, с. 241], хотя некоторые авторы применяют большую дозировку (50,0 мкг/100г) в течение одного месяца [8, с. 57], возможно, преследуя цель создания тиреотоксикоза. Таблетку в 50,0 мкг левотироксина («Берлин-Хеми», Германия) растирали в фарфоровой ступке и растворяли в 5,0 мл водопроводной воды. В этом случае в 1,0 мл будет 10,0 мкг гормона, и поэтому на 100 г веса крыс мы вводили 0,5 мл, в которых было 5,0 мкг левотироксина. На следующий день после двухнедельного введения гормона этих крыс также помещали на шесть часов в мочеприемники со сбором мочи, в которой определяли все те же показатели, и опять у 10 крыс, также в состоянии наркотического сна, определяли скорость почечного кровотока, брали кровь и почки и проводили все те же исследования, о которых мы уже писали.

На оставшихся 24 крысах с гипертиреозом мы решили исследовать чувствительность почек к антидиуретическому гормону в условиях водной нагрузки. Для этого крыс разделили на две группы, по 12 в каждой. Одним ввели только водопроводную воду в объёме 5,0% их веса, а другим вместе с ней еще и антидиуретический гормон, в качестве которого применяли десмопрессин (минирин, Швейцария) в дозе 0,15 мкг/100г.

Полученные результаты статистически обрабатывались с помощью компьютерной программы GraphPad Prizm 6.03, степень достоверности параметрического метода сравнения средних величин (М±m) контрольных и опытных значений оценивалась по t-критерию Стьюдента, а учёт нормальности распределения данных производился на основании критерия Шапиро - Уилка.

Содержание и уход за крысами, постановка и выведение их из опытов в состоянии обезболивания проводили в соответствии с Приказом Минздравсоцразвития России № 708н от 23 августа 2010 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики». Разрешение на проведение экспериментов было дано этическим комитетом академии 29 ноября 2019 года, протокол № 9.5.

Результаты исследования и их обсуждение. После двухнедельного введения крысам левотироксина в дозе 5,0 мкг/100 г и определения на следующий день содержания в плазме крови свободных три- и тетрайодтиронинов обнаружилось их статистически значимо повышение с контрольных уровней в 3,72±0,35 и 22,06±1,87 пмоль/л до 7,58±0,54 пмоль/л (Т3, р<0,001) и 41,70±2,92 пмоль/л (Т4, р<0,001) соответственно. То есть повышение трийодтиронина в 2,0 раза, а тироксина в 1,9 раза говорит об успешном создании гипертиреоза, а также характерном усилении обмена веществ, снижающем вес крыс (175±18г).

Количество выделившейся мочи с расчётом на диурез за один час показало статистически значимое (р<0,005) повышение шестичасового спонтанного диуреза (табл. 1). Причиной этого было ускорение клубочковой фильтрации, так как процесс обратного всасывания воды не изменился (табл. 1). Уровень креатинина в плазме крови при гипертиреозе лишь только незначительно снизился с 76,28±3,25 до 72,44±3, 58 мкмоль/л.

Таблица 1

Спонтанный диурез и основные процессы мочеобразования

Для выяснения того, что могло быть причиной ускорения клубочковой фильтрации и неизменности канальцевой реабсорбции воды, мы определили объёмную скорость почечного кровотока и осмотическое давление в слоях ткани почек по содержанию в них осмотически активных веществ – мочевины и натрия. Первый из этих исследуемых показатель у крыс контрольной группы был 10,12±0,74 мл/мин., а у опытных крыс – 14,36±0,95 мл/мин., что имело достоверное отличие (р<0,005). И если провести сравнение, насколько при гипертиреозе произошло повышение диуреза, клубочковой фильтрации и скорости почечного кровотока, то можно отметить следующее: диурез повысился на 42,1%, клубочковая фильтрация – на 41,3%, а скорость почечного кровотока – на 41,9%, то есть практически в одинаковом объёме, что и логично при неизменившейся канальцевой реабсорбции воды. И первоначальное ускорение объёмной скорости почечного кровотока вызвало равнозначное усиление скорости гломерулярной фильтрации и повышение количества выделившейся мочи.

Определение содержания мочевины и натрия в слоях ткани почек (в корковом и мозговом веществах, в почечном сосочке) показало, что они отличались от контрольных данных всего лишь в пределах статистических колебаний (табл. 2).

Таблица 2

Содержание мочевины и натрия в слоях ткани почек

И если условно общее осмотическое давление в ткани почек, создаваемое мочевиной, у контрольных крыс принять за 100%, то у гипертиреозных оно было на 5,5% меньше, а по натрию, наоборот, на 8,1% больше, то есть общее осмотическое давление при гипертиреозе практически не изменилось, поэтому и канальцевая реабсорбция осталась на прежнем уровне. Не изменилось и процентное содержание воды в ткани слоёв почек после двухнедельного введения крысам L-тироксина (табл. 2), что еще раз подтверждает отсутствие влияния на осмотическое давление.

Определение уровня общего белка в моче показало, что введение левотироксина натрия способствовало повышению протеинурии, которая у контрольных была 1,12±0,09 мг/мл, а у опытных – 1,75±0,16 мг/мл (р<0,01). Именно определение степени протеинурии, а не экскреции белка с мочой является более правильным, так как если рассчитывать экскрецию в тех случаях, когда повышается диурез, то полученное значение будет больше реального, а именно по содержанию белка в моче можно судить об истинном состоянии клубочково-канальцевого аппарата почек. Выявленная протеинурия при гипертиреозе не отразилась на уровне общего белка в плазме крови (67,25±3,29 г/л - контроль, 64,72±2,85 г/л - опыт).

Выяснение влияния гипертиреоза на ионовыделительную функцию почек, в частности натрия и калия, показало, что их содержание в плазме крови особо не изменилось, имея лишь тенденции в сторону повышения для натрия и снижения для калия (табл. 3). Что касается их обработки на уровне почек, то в этом случае выявленные изменения имели статистически значимые отличия. Экскреция натрия достоверно (р<0,05) снизилась, несмотря на то что его фильтрационный заряд с контрольного уровня в 2023,6±128,4 мкмоль/час/100 г повысился в 1,45 раза, что было обусловлено ускорением клубочковой фильтрации, а уменьшение выделения натрия с мочой было обусловлено усилением его канальцевой реабсорбции (табл. 3), что и способствовало снижению экскретируемой фракции натрия с 0,45±0,06% до 0,24±0,05% (р<0,05) и, соответственно, самой экскреции.

Таблица 3

Содержание натрия и калия в плазме крови и показатели их обработки в почках

Выявленный же гипертиреозный калийурез, имеющий достоверное отличие от контроля (р<0,05), был вызван повышением фильтрационного заряда (табл. 3). И так как калий, в отличие от натрия, в канальцах почек еще и секретируется, то судить о величине его реабсорбции не представляется возможным, но очевидно, что секреция калия не повлияла на повышение его экскреции, которая увеличилась на такую же величину (28,1%), на какую повысился фильтрационный заряд (29,5%).

Определение влияния гипертиреоза на интенсивность перекисного окисления липидов показало, что содержание гидроперекисей в плазме крови статистически значимо повысилось с 4,86±0,33 до 6,45±0,47 мкмоль/л (р<0,01), так же как и малонового диальдегида (32,55±2,46 мкмоль/л – контроль, 47,23±3,35 мкмоль/л – гипертиреоз, р<0,01). В ответ на усиление пероксидации липидов активность ферментов антиоксидантной защиты также повысилась. Каталаза с величины, рассчитанной на 1 г гемоглобина и равной 4,06±0,28 10-4МЕ/1гHb в контроле, до 5,87±0,34 10-4МЕ/1гHb (р<0,005), а супероксиддисмутаза – с 67,18±3,37 ед. ингибир. до 78,92±3,83 ед. ингибир. (р<0,05). Одновременное усиление и перекисного окисления липидов, и активности антиоксидантной защиты говорит о том, что повышение в крови содержания три- и тетрайодтиронинов, способных ускорить обмен веществ, стимулирует и пероксидацию липидов, а в ответ повышается активность ферментов защиты. Кроме того, стоит отметить, что часто при продолжительном усилении перекисного окисления липидов активность антиоксидантной защиты истощается, но в нашем случае, с двухнедельным введением L-тироксина, этого не произошло, что, возможно, было обусловлено непродолжительным введением или не столь большой дозировкой. Полученные нами результаты перекисного окисления липидов и состояние антиоксидантной системы после введения крысам L-тироксина подтверждают другие авторы, которые еще отмечали уменьшение количества эритроцитов и гемоглобина [9, с. 33].

И последний вопрос, который мы хотели выяснить, это состояние чувствительности канальцевого аппарата почек к антидиуретическому гормону. Ранее нами было показано, что введение крысам десмопрессина (аналог аргинин-вазопрессина с замещением L-аргинина на D-аргинин и удлинённым, до 8 часов, антидиуретическим действием по сравнению с нативным гормоном), доза которого в 0,15 мкг/100 г была рассчитана эмпирически так, чтобы продолжительность антидиуреза была не более двух часов, полностью блокировало выделение мочи в течение первого часа у 21 крысы (75,0%) после введения им 5,0% от веса водной нагрузки водопроводной водой, а у оставшихся 7 (25,0%) в три раза снизило [10]. Причиной снижения диуреза было повышение канальцевой реабсорбции. За второй час диурез был уже у всех крыс, но все-таки на 47,9% меньше, чем у контрольных животных, и также из-за большего обратного всасывания воды в канальцах почек.

Выяснив влияние гипертиреоза на основные процессы мочеобразования, мы решили уточнить чувствительность рецепторов канальцев к антидиуретическому гормону в этих условиях. Для решения этой цели, как мы отметили в «Материалах и методах», после завершения опыта с шестичасовым сбором мочи оставшихся 24 крыс разделили на две группы, одни из которых получали только 5,0% водную нагрузку, а другие с десмопрессином. После чего всех животных посадили в мочесборники и собирали в течение двух часов, отдельно по каждому часу, выделяющуюся мочу, в которой определяли креатинин для последующего расчёта скорости клубочковой фильтрации и объёма канальцевой реабсорбции воды. И если введение десмопрессина здоровым крысам вызывало в большинстве случаев блокировку выделения мочи за первый час, то при гипертиреозе этого не происходило и диурез стал только незначительно меньше (табл. 4). Не было отличий и за второй час. Без изменений были и основные процессы мочеобразования. То есть при повышенном уровне в крови йодсодержащих гормонов отмечается снижение чувствительности канальцевого аппарата почек к антидиуретическому гормону.

Таблица 4

Диурез и основные процессы мочеобразования у гипертиреозных крыс под влиянием антидиуретического гормона

Чем обусловлено снижение чувствительности канальцев почек к антидиуретическому гормону? Возможно, это связано с конкурирующим влиянием гормонов на одинаковые рецепторы. В частности, высокий уровень в крови активного трийодтиронина оказывает влияние не только на свои мембранные Gs-белок-опосредованные рецепторы, но, очевидно, и на чувствительные к антидиуретическому гормону V2-рецепторы базолатеральной мембраны канальцев почек, которые также относятся к этому семейству рецепторов [11; 12].

Заключение. Таким образом, при экспериментальном гипертиреозе, создаваемом на крысах линии Вистар двухнедельным введением левотироксина натрия в дозе 5,0 мкг/100г веса животных, отмечается повышение в крови содержания три- и тетрайодтиронинов, спонтанного диуреза из-за усиления клубочковой фильтрации вследствие ускорения объёмной скорости почечного кровотока. Канальцевая реабсорбция воды, осмотическое давление и содержание воды в слоях почек не изменились, а чувствительность тубулярного аппарата к антидиуретическому гормону ослабла. Выявилась повышенная протеинурия, но уровень белка в крови не претерпел изменений. Экскреция натрия с мочой снизилась вследствие усиления канальцевой реабсорбции, а калия повысилась из-за увеличения фильтрационного заряда. Содержание ионов в крови не изменилось. Одновременно отмечалось усиление пероксидации липидов в виде повышения гидроперекисей и малонового диальдегида, но вместе с тем повысилась активность ферментов антиоксидантной защиты – каталазы и супероксиддисмутазы.