Среди многочисленных исследований в области диагностики и лечения онкологических заболеваний важным аспектом является поиск мишеней и фармакологических таргетных агентов для воздействия на эти мишени [1]. Процесс разработки лекарственного препарата обусловливает необходимость подтверждения безопасности и эффективности нового соединения. В данном аспекте привлекательными для исследования являются соединения бензимидазола, которые сходны по структуре с нуклеиновыми кислотами, в связи с чем обладают широким спектром фармакологической активности, в частности противоопухолевой [2]. В исследованиях установлена также их значительная безопасность [3].
Противоопухолевую активность производных бензимидазола связывают с их действием на различные киназы, участвующие в клеточном метаболизме, направленным действием в отношении ДНК-топоизомераз и апоптотических белков, а также ферментов окислительного стресса и т.д. Злокачественная трансформация клеток в данном аспекте связана со способностью дериватов бензимидазола ингибировать активность киназ контрольной точки деления клетки – check point kinase 2 [4], циклинзависимых киназ [5], онкогенных киназ MEK1 и PI3K [6], ингибировать поли(ADP-рибоза)полимеразы (PARP) -1 и -2 [7-8], ДНК-топоизомеразы [9]. Кроме того, мишенью противоопухолевого действия производных бензимидазола является белок клеточного деления тубулин [10]. За счет механизма активации компонентов процесса апоптоза производные бензимидазола проявляют выраженную антипролиферативную активность [11,12].
В исследованиях показано, что производные бензимидазола относятся к группе соединений, обладающих антиоксидантной и антирадикальной активностью, в связи с чем они также могут проявлять противоопухолевое действие [13]. Показано, что действие синтетических субстанций на основе бензимидазола может быть направлено на ферменты, участвующие в антиоксидантной защите [14]. Однако некоторые авторы указывают на проопухолевую активность антиоксидантов, а также их потенции в отношении опухолевой прогрессии [15].
Оценка противоопухолевой эффективности лекарственных средств проводится на рекомендованных сингенных опухолевых моделях, воспроизведенных на линейных мышах [16], для чего необходимо определение показателей токсичности новых субстанций у таких животных с дальнейшим расчетом доз для исследования специфической активности.
Целью исследования явилось определение острой токсичности дигидробромида 2- (3,4-дигидроксифенил) -9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-a] бензимидазола (далее – РУ-185) при однократном введении мышам линии С57/Bl6.
Материал и методы исследования
Исследование было проведено на 110 мышах линии С57/Bl6 обоего пола весом 18–20 г согласно протоколу биоэтической комиссии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (№ 19 от 22.09.2015) в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики ГОСТ 33044-2014 [17] и правилами Европейской̆ Конвенции ETS 123 [18].
Проводили оценку острой токсичности фармакологической субстанции дигидробромида 2- (3,4-дигидроксифенил) -9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-a] бензимидазола, характеристики которой были подтверждены методами ЯМР-и ИК-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа. Исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе и осуществляли введение внутрижелудочно (с помощью назогастрального зонда) и внутрибрюшинно.
В соответствии с межгосударственным стандартом [19] изучение острой токсичности РУ-185 выполнялось в два этапа (табл. 1). Все мыши были разделены на 2 группы для каждого способа введения: экспериментальные, которым вводили исследуемое вещество, и контрольные, которым вводили изотонический раствор хлористого натрия, в объемах по 0,5 мл. На предварительном этапе исследуемое вещество вводили последовательно, начальная доза составляла 5,0 мг/кг. Последующие дозы согласно рекомендациям вводили через 72 часа. За каждым животным наблюдали первые 2 суток, а затем ежедневно последующие 7 дней. Оценивали общее состояние мышей и показатели летальности. Эвтаназию выживших животных проводили дислокацией шейных позвонков на 7-е сутки.
Таблица 1
Дизайн эксперимента: количество животных в группах и применяемые дозы.
Показатели |
Группы животных |
||||||||||
Экспериментальные |
Контрольная |
Экспериментальные |
Контрольная |
||||||||
Этап исследования |
Предварительный этап |
Основной этап |
|||||||||
Количество животных* |
♂ |
– |
– |
– |
– |
– |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
♀ |
1/1 |
1/1 |
1/1 |
1/1 |
1/1 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
5/5 |
|
Разовые дозы, мг/кг |
5,0 |
50,0 |
300,0 |
2000,0 |
0 |
250,0 |
500,0 |
1000,0 |
2000,0 |
0 |
Примечание: * – количество животных для внутрижелудочного / количество животных для внутрибрюшинного введения РУ-185
В соответствии с полученными результатами на предварительном этапе исследования для основного этапа были рассчитаны дозы РУ-185, которые вводили однократно (табл. 1). Животных наблюдали индивидуально каждые 30 минут в течение 24 часов, а затем ежедневно в течение 14 дней.
Расчет величин летальных доз производился с помощью метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности [20]. Оценку массы тела животных проводили на 1–4-е сутки ежедневно, а затем на 7-е и 14-е сутки эксперимента. Также на основном этапе эксперимента проводили исследование влияния вещества РУ-185 на функционально-поведенческий статус животных при обоих способах введения субстанции (табл. 2).
Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью программы STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США). Для оценки нормальности распределения использовали критерии Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Для оценки достоверности различий средних величин независимых выборок применяли критерий Манна–Уитни с установленным уровнем значимости p<0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
На предварительном этапе исследования в обеих экспериментальных группах при введении субстанции в дозах 5,0 мг/кг, 50,0 мг/кг, 300,0 мг/кг не было зарегистрировано гибели животных, не наблюдались изменения внешнего вида, поведения и не отмечалось нарушений двигательной активности. После введения РУ-185 независимо от способа введения в дозе 2000,0 мг/кг у животных в течение первых 2 часов наблюдались признаки токсического отравления с последующей гибелью.
При анализе результатов основного этапа эксперимента в группах после внутрижелудочного введения РУ-185 в дозах 1000,0 мг/кг и 2000,0 мг/кг у животных наблюдались признаки токсического отравления, такие как: адинамия, снижение частоты груминга и реакций на болевые и тактильные стимулы, учащение частоты дыхания с последующим урежением (табл. 2). Также в этих группах отмечалось снижение груминга и спонтанной двигательной активности на 25% и 50% относительно контрольной группы при p=0,03 и p=0,02 соответственно (табл. 2). При прогрессировании токсического эффекта наблюдались тремор, подергивание конечностей и судороги, вегетотропные эффекты в виде снижения реакции зрачка, повышения уринаций. Аналогичная картина наблюдалась при внутрибрюшинном способе введения РУ-185, однако некоторые токсические признаки проявлялись и были более выражены уже при введении дозы 500 мг/кг – снижение реакции на прикосновение, боль, стук, настороженности.
Таблица 2
Функционально-поведенческий статус мышей линий С57/Bl6 на основном этапе исследования острой токсичности РУ-185
Тестируемые параметры, баллы |
Дозы, мг/кг |
|||||||||
Внутрижелудочно |
Внутрибрюшинно |
|||||||||
К |
250 |
500 |
1000 |
2000 |
К |
250 |
500 |
1000 |
2000 |
|
Поведенческие реакции |
||||||||||
Вокализация |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Настороженность |
4 |
4 |
4 |
3 |
3 |
4 |
4 |
3 |
3 |
1 |
Активность |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
Стереотипия |
0 |
0 |
0 |
4 |
6 |
0 |
0 |
0 |
4 |
6 |
Беспокойство |
0 |
0 |
1 |
6 |
8 |
0 |
0 |
0 |
2 |
7 |
Агрессия |
0 |
0 |
0 |
4 |
5 |
0 |
0 |
0 |
4 |
4 |
Груминг |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
Спонтанная двигательная активность |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
Нервно-мышечная возбудимость |
||||||||||
Реакция на прикосновение |
4 |
4 |
4 |
3 |
3 |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
Реакция на боль |
4 |
4 |
4 |
3 |
2 |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
Реакция на стук |
4 |
4 |
4 |
3 |
3 |
4 |
4 |
3 |
3 |
2 |
Тремор |
0 |
0 |
0 |
3 |
6 |
0 |
0 |
0 |
4 |
6 |
Подергивание |
0 |
0 |
0 |
4 |
7 |
0 |
0 |
0 |
5 |
7 |
Судороги |
0 |
0 |
0 |
4 |
7 |
0 |
0 |
0 |
4 |
7 |
Расстройство походки |
0 |
0 |
0 |
3 |
6 |
0 |
0 |
0 |
4 |
6 |
Тонус конечностей |
4 |
4 |
4 |
3 |
2 |
4 |
4 |
4 |
3 |
2 |
Вегетативные эффекты |
||||||||||
Положение мигательной перепонки |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
Размер зрачка |
4 |
4 |
4 |
3 |
3 |
4 |
4 |
4 |
3 |
3 |
Саливация |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
1 |
3 |
Уринация |
0 |
0 |
0 |
5 |
7 |
0 |
0 |
0 |
5 |
7 |
Дефекация |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Ректальная температура |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Цвет кожи |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
4 |
Частота дыхания |
0 |
0 |
0 |
5 |
7 |
0 |
0 |
0 |
4 |
8 |
Примечание: К – контрольная группа; оценку функционально-поведенческого статуса проводят в шкалах от 0 до 8 баллов, где: в шкалах внешнего проявления поведения 4 балла соответствует нормальной оценке параметра, от 4–8 баллов – увеличение эффекта, от 4 до 0 – угнетение эффекта, а изменение параметра в 1 балл соответствует изменению параметра в среднем на 25%; в шкалах токсического профиля: 8 – максимальное проявление признака, а 0 баллов – отсутствие признаков интоксикации.
Гибель животных наблюдалась в течение первых 4 дней, однако в последующие дни эксперимента падение животных не регистрировалось (табл. 3). Анализ статистики летальных эффектов в исследуемых группах позволил произвести расчет величин летальных доз, который показал, что при внутрижелудочном введении РУ-185 величина ЛД50 составила 1807,9±226,1 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 1803,4±218,9 мг/кг (табл. 3). Расчетные летальные дозы для внутрижелудочного введения: LD16=1093,01 мг/кг, LD84 = 2522,9 мг/кг, LD100=2880,4 мг/кг. Расчетные летальные дозы для внутрибрюшинного введения: LD16=1045,45 мг/кг, LD84 = 2504,8 мг/кг, LD100=2800,2 мг/кг.
Таблица 3
Статистика летальных эффектов при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении РУ-185 мышам линии С57/Bl6 на основном этапе исследования
Способ введения |
Доза, мг/кг |
Результаты исследования |
Эффект в пробитах |
|||
Самки |
Самцы |
|||||
Павшие животные |
Всего животных |
Павшие животные |
Всего животных |
|||
Внутрижелудочно |
250,0 |
0 |
5 |
0 |
5 |
2,95 |
500,0 |
0 |
5 |
0 |
5 |
2,95 |
|
1000,0 |
2 |
5 |
1 |
5 |
4,48 |
|
2000,0 |
2 |
5 |
2 |
5 |
4,75 |
|
0 (контроль) |
0 |
5 |
0 |
5 |
– |
|
Внутрибрюшинно |
250,0 |
0 |
5 |
0 |
5 |
2,95 |
500,0 |
1 |
5 |
0 |
5 |
3,72 |
|
1000,0 |
2 |
5 |
1 |
5 |
4,48 |
|
2000,0 |
2 |
5 |
2 |
5 |
4,75 |
|
0 (контроль) |
0 |
5 |
0 |
5 |
– |
Оценка динамики прироста массы тела выживших после введения животных установила, что после внутрижелудочного введения РУ-185 прирост массы тела у самцов и самок к окончанию эксперимента был статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе (p<0,05). После введения РУ-185 в дозе 1000 мг/кг и 2000 мг/кг в первые 3 суток у животных отмечалось снижение массы тела относительно исходных значений на 2,4±0,3 г и 3,4±0,2 г соответственно, а далее отмечался прирост к 14-м суткам эксперимента на 2,1±0,1 г и 1,4±0,2 г соответственно. Однако обнаружены статистически значимые межгрупповые различия для животных обоего пола в процентном приросте массы тела при введении доз 1000 мг/кг и 2000 мг/кг. Так, на 7-е сутки после введения доз РУ-185 1000 и 2000 мг/кг прирост массы в среднем был ниже относительно контроля в 4,2 и 5,3 раза соответственно, а на 14-е сутки – в 5,7 и 7,1 раза соответственно (для всех случаев при р<0,05). После внутрижелудочного введения РУ-185 в дозе 500 мг/кг у самцов прирост массы тела был отмечен на 2-е сутки эксперимента на 11,1±2,0%, у самок – на 4-е сутки на 13,3±1,7%, а в дозе 250 мг/кг прирост массы тела наблюдался на 1-е сутки эксперимента у животных обоего пола, но к окончанию эксперимента был ниже в среднем в 1,5 раза для дозы 500 мг/кг и в 1,3 раза для дозы 250 мг/кг ниже, чем у животных контрольной группы (при p<0,05 для всех случаев).
Аналогичная динамика массы тела обнаружена при исследовании прироста массы тела у животных после внутрибрюшинного введения РУ-185 и установлено, что у животных обоего пола в течение эксперимента прирост массы тела был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе (p<0,05). Введение РУ-185 в дозе 2000 мг/кг у мышей обоего пола вызывало снижение массы тела в 1-е сутки относительно исходных цифр в среднем на 15,3±1,1%, однако к 14-м суткам эксперимента у выживших животных отмечался незначительный прирост массы. После введения РУ-185 в дозе 1000 мг/кг отмечались половые различия: у самцов прирост массы тела на 1,6±0,5 г относительно исходных значений был отмечен к 3-м суткам эксперимента, у самок был зарегистрирован начиная с 4-х суток на 3,2±0,3 г. После введения РУ-185 в дозах 250,0 мг/кг и 500,0 мг/кг у самцов и самок наблюдался прирост массы тела с 1-х суток эксперимента в среднем на 10,2±2,1% и 7,1±1,2% соответственно. К окончанию эксперимента прирост массы тела для всех применяемых доз был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе: после внутрибрюшинного введения доз 250, 500, 1000 и 2000 мг/кг – в 2,4 раза, 4,1 раза, 5,5 и 6,8 раза соответственно (для всех случаев при р<0,05).
Заключение
Оценка острой токсичности РУ-185 на мышах линии С57/Bl6 показала, что значение LD50 при внутрижелудочном введении составило 1807,9±226,1 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 1803,4±218,9 мг/кг. Полученные результаты исследования позволяют рассчитать дозы для внутрижелудочного и внутрибрюшинного введения РУ-185 для дальнейшей оценки его специфической противоопухолевой активности на линейных мышах С57/Bl6, которые используются в качестве моделей для исследования сингенных опухолей.
Библиографическая ссылка
Комарова Е.Ф., Вереникина Е.В., Шевченко Н.А., Гончарова А.С., Аллилуева Е.В., Галина А.В., Гурова С.В., Курбанова Л.З., Романова М.В., Ходакова Д.В., Морковник А.С., Жуковская О.Н., Шевченко А.Н., Григорян Э.С., Арапова Ю.Ю. ОЦЕНКА ТОКСИКОМЕТРИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРОИЗВОДНОГО БЕНЗИМИДАЗОЛА ДЛЯ ЛИНЕЙНЫХ МЫШЕЙ С57/BL6 // Современные проблемы науки и образования. – 2023. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=32499 (дата обращения: 13.10.2024).