Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Среди многочисленных исследований в области диагностики и лечения онкологических заболеваний важным аспектом является поиск мишеней и фармакологических таргетных агентов для воздействия на эти мишени [1]. Процесс разработки лекарственного препарата обусловливает необходимость подтверждения безопасности и эффективности нового соединения. В данном аспекте привлекательными для исследования являются соединения бензимидазола, которые сходны по структуре с нуклеиновыми кислотами, в связи с чем обладают широким спектром фармакологической активности, в частности противоопухолевой [2]. В исследованиях установлена также их значительная безопасность [3].

Противоопухолевую активность производных бензимидазола связывают с их действием на различные киназы, участвующие в клеточном метаболизме, направленным действием в отношении ДНК-топоизомераз и апоптотических белков, а также ферментов окислительного стресса и т.д. Злокачественная трансформация клеток в данном аспекте связана со способностью дериватов бензимидазола ингибировать активность киназ контрольной точки деления клетки – check point kinase 2 [4], циклинзависимых киназ [5], онкогенных киназ MEK1 и PI3K [6], ингибировать поли(ADP-рибоза)полимеразы (PARP) -1 и -2 [7-8], ДНК-топоизомеразы [9]. Кроме того, мишенью противоопухолевого действия производных бензимидазола является белок клеточного деления тубулин [10]. За счет механизма активации компонентов процесса апоптоза производные бензимидазола проявляют выраженную антипролиферативную активность [11,12].

В исследованиях показано, что производные бензимидазола относятся к группе соединений, обладающих антиоксидантной и антирадикальной активностью, в связи с чем они также могут проявлять противоопухолевое действие [13]. Показано, что действие синтетических субстанций на основе бензимидазола может быть направлено на ферменты, участвующие в антиоксидантной защите [14]. Однако некоторые авторы указывают на проопухолевую активность антиоксидантов, а также их потенции в отношении опухолевой прогрессии [15].

Оценка противоопухолевой эффективности лекарственных средств проводится на рекомендованных сингенных опухолевых моделях, воспроизведенных на линейных мышах [16], для чего необходимо определение показателей токсичности новых субстанций у таких животных с дальнейшим расчетом доз для исследования специфической активности.

Целью исследования явилось определение острой токсичности дигидробромида 2- (3,4-дигидроксифенил) -9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-a] бензимидазола (далее – РУ-185) при однократном введении мышам линии С57/Bl6.

Материал и методы исследования

Исследование было проведено на 110 мышах линии С57/Bl6 обоего пола весом 18–20 г согласно протоколу биоэтической комиссии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (№ 19 от 22.09.2015) в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики ГОСТ 33044-2014 [17] и правилами Европейской̆ Конвенции ETS 123 [18].

Проводили оценку острой токсичности фармакологической субстанции дигидробромида 2- (3,4-дигидроксифенил) -9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-a] бензимидазола, характеристики которой были подтверждены методами ЯМР-и ИК-спектроскопии, рентгеноструктурного анализа. Исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе и осуществляли введение внутрижелудочно (с помощью назогастрального зонда) и внутрибрюшинно.

В соответствии с межгосударственным стандартом [19] изучение острой токсичности РУ-185 выполнялось в два этапа (табл. 1). Все мыши были разделены на 2 группы для каждого способа введения: экспериментальные, которым вводили исследуемое вещество, и контрольные, которым вводили изотонический раствор хлористого натрия, в объемах по 0,5 мл. На предварительном этапе исследуемое вещество вводили последовательно, начальная доза составляла 5,0 мг/кг. Последующие дозы согласно рекомендациям вводили через 72 часа. За каждым животным наблюдали первые 2 суток, а затем ежедневно последующие 7 дней. Оценивали общее состояние мышей и показатели летальности. Эвтаназию выживших животных проводили дислокацией шейных позвонков на 7-е сутки.

Таблица 1

Дизайн эксперимента: количество животных в группах и применяемые дозы.

Примечание: * – количество животных для внутрижелудочного / количество животных для внутрибрюшинного введения РУ-185

В соответствии с полученными результатами на предварительном этапе исследования для основного этапа были рассчитаны дозы РУ-185, которые вводили однократно (табл. 1). Животных наблюдали индивидуально каждые 30 минут в течение 24 часов, а затем ежедневно в течение 14 дней.

Расчет величин летальных доз производился с помощью метода наименьших квадратов для пробит-анализа кривых летальности [20]. Оценку массы тела животных проводили на 1–4-е сутки ежедневно, а затем на 7-е и 14-е сутки эксперимента. Также на основном этапе эксперимента проводили исследование влияния вещества РУ-185 на функционально-поведенческий статус животных при обоих способах введения субстанции (табл. 2).

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью программы STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc., США). Для оценки нормальности распределения использовали критерии Шапиро–Уилка и Колмогорова–Смирнова. Для оценки достоверности различий средних величин независимых выборок применяли критерий Манна–Уитни с установленным уровнем значимости p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

На предварительном этапе исследования в обеих экспериментальных группах при введении субстанции в дозах 5,0 мг/кг, 50,0 мг/кг, 300,0 мг/кг не было зарегистрировано гибели животных, не наблюдались изменения внешнего вида, поведения и не отмечалось нарушений двигательной активности. После введения РУ-185 независимо от способа введения в дозе 2000,0 мг/кг у животных в течение первых 2 часов наблюдались признаки токсического отравления с последующей гибелью.

При анализе результатов основного этапа эксперимента в группах после внутрижелудочного введения РУ-185 в дозах 1000,0 мг/кг и 2000,0 мг/кг у животных наблюдались признаки токсического отравления, такие как: адинамия, снижение частоты груминга и реакций на болевые и тактильные стимулы, учащение частоты дыхания с последующим урежением (табл. 2). Также в этих группах отмечалось снижение груминга и спонтанной двигательной активности на 25% и 50% относительно контрольной группы при p=0,03 и p=0,02 соответственно (табл. 2). При прогрессировании токсического эффекта наблюдались тремор, подергивание конечностей и судороги, вегетотропные эффекты в виде снижения реакции зрачка, повышения уринаций. Аналогичная картина наблюдалась при внутрибрюшинном способе введения РУ-185, однако некоторые токсические признаки проявлялись и были более выражены уже при введении дозы 500 мг/кг – снижение реакции на прикосновение, боль, стук, настороженности.

Таблица 2

Функционально-поведенческий статус мышей линий С57/Bl6 на основном этапе исследования острой токсичности РУ-185

Примечание: К – контрольная группа; оценку функционально-поведенческого статуса проводят в шкалах от 0 до 8 баллов, где: в шкалах внешнего проявления поведения 4 балла соответствует нормальной оценке параметра, от 4–8 баллов – увеличение эффекта, от 4 до 0 – угнетение эффекта, а изменение параметра в 1 балл соответствует изменению параметра в среднем на 25%; в шкалах токсического профиля: 8 – максимальное проявление признака, а 0 баллов – отсутствие признаков интоксикации.

Гибель животных наблюдалась в течение первых 4 дней, однако в последующие дни эксперимента падение животных не регистрировалось (табл. 3). Анализ статистики летальных эффектов в исследуемых группах позволил произвести расчет величин летальных доз, который показал, что при внутрижелудочном введении РУ-185 величина ЛД50 составила 1807,9±226,1 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 1803,4±218,9 мг/кг (табл. 3). Расчетные летальные дозы для внутрижелудочного введения: LD16=1093,01 мг/кг, LD84 = 2522,9 мг/кг, LD100=2880,4 мг/кг. Расчетные летальные дозы для внутрибрюшинного введения: LD16=1045,45 мг/кг, LD84 = 2504,8 мг/кг, LD100=2800,2 мг/кг.

Таблица 3

Статистика летальных эффектов при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении РУ-185 мышам линии С57/Bl6 на основном этапе исследования

Оценка динамики прироста массы тела выживших после введения животных установила, что после внутрижелудочного введения РУ-185 прирост массы тела у самцов и самок к окончанию эксперимента был статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе (p<0,05). После введения РУ-185 в дозе 1000 мг/кг и 2000 мг/кг в первые 3 суток у животных отмечалось снижение массы тела относительно исходных значений на 2,4±0,3 г и 3,4±0,2 г соответственно, а далее отмечался прирост к 14-м суткам эксперимента на 2,1±0,1 г и 1,4±0,2 г соответственно. Однако обнаружены статистически значимые межгрупповые различия для животных обоего пола в процентном приросте массы тела при введении доз 1000 мг/кг и 2000 мг/кг. Так, на 7-е сутки после введения доз РУ-185 1000 и 2000 мг/кг прирост массы в среднем был ниже относительно контроля в 4,2 и 5,3 раза соответственно, а на 14-е сутки – в 5,7 и 7,1 раза соответственно (для всех случаев при р<0,05). После внутрижелудочного введения РУ-185 в дозе 500 мг/кг у самцов прирост массы тела был отмечен на 2-е сутки эксперимента на 11,1±2,0%, у самок – на 4-е сутки на 13,3±1,7%, а в дозе 250 мг/кг прирост массы тела наблюдался на 1-е сутки эксперимента у животных обоего пола, но к окончанию эксперимента был ниже в среднем в 1,5 раза для дозы 500 мг/кг и в 1,3 раза для дозы 250 мг/кг ниже, чем у животных контрольной группы (при p<0,05 для всех случаев).

Аналогичная динамика массы тела обнаружена при исследовании прироста массы тела у животных после внутрибрюшинного введения РУ-185 и установлено, что у животных обоего пола в течение эксперимента прирост массы тела был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе (p<0,05). Введение РУ-185 в дозе 2000 мг/кг у мышей обоего пола вызывало снижение массы тела в 1-е сутки относительно исходных цифр в среднем на 15,3±1,1%, однако к 14-м суткам эксперимента у выживших животных отмечался незначительный прирост массы. После введения РУ-185 в дозе 1000 мг/кг отмечались половые различия: у самцов прирост массы тела на 1,6±0,5 г относительно исходных значений был отмечен к 3-м суткам эксперимента, у самок был зарегистрирован начиная с 4-х суток на 3,2±0,3 г. После введения РУ-185 в дозах 250,0 мг/кг и 500,0 мг/кг у самцов и самок наблюдался прирост массы тела с 1-х суток эксперимента в среднем на 10,2±2,1% и 7,1±1,2% соответственно. К окончанию эксперимента прирост массы тела для всех применяемых доз был статистически значимо ниже, чем в контрольной группе: после внутрибрюшинного введения доз 250, 500, 1000 и 2000 мг/кг – в 2,4 раза, 4,1 раза, 5,5 и 6,8 раза соответственно (для всех случаев при р<0,05).

Заключение

Оценка острой токсичности РУ-185 на мышах линии С57/Bl6 показала, что значение LD50 при внутрижелудочном введении составило 1807,9±226,1 мг/кг, при внутрибрюшинном введении – 1803,4±218,9 мг/кг. Полученные результаты исследования позволяют рассчитать дозы для внутрижелудочного и внутрибрюшинного введения РУ-185 для дальнейшей оценки его специфической противоопухолевой активности на линейных мышах С57/Bl6, которые используются в качестве моделей для исследования сингенных опухолей.