Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

На начальном этапе опухолевого роста существенную роль играет процесс эпителиально-мезенхимального перехода, который сопровождается потерей межклеточных контактов, перестройкой цитоскелета, активацией синтеза ферментов, способных приводить к деградации внеклеточного матрикса, что позволяет эпителиальным клеткам, приобретшим мезенхимальный фенотип, активно перемещаться и проходить через базальную мембрану [1], обусловливая инвазивную способность опухолевых клеток. Кроме того, клетки, подвергшиеся эпителиально-мезенхимальной трансформации и изменившие свой фенотип, становятся способными к продукции компонентов внеклеточного матрикса.

Так, одним из таких веществ, относящихся к группе мезенхимальных маркеров, способствующих подвижности и инвазии, наряду с Н-катгерином, виментином, матриксными металлопротеиназами, β1 и β3 интегринами является фибронектин [2], экспрессия которого свидетельствует о развитии TGFβ-индуцированного эпителиально-мезенхимального перехода [3]. Известно, что повышение экспрессии фибронектина при раке молочной железы связано с плохим клиническим исходом и способствует метастазированию [4].

В настоящее время установлено, что клеточный цикл, в результате которого происходит образование двух идентичных дочерних клеток, управляется циклинами в их связке с циклин-зависимыми киназами (ЦЗК). При этом образуются гетеродимерные комплексы циклинов D-типа (D1, D2 и D3) с ЦЗК4 или ЦЗК6 [5] для контроля фазового перехода G1 в S, тем самым инициируя репликацию ДНК. Экспрессия, активация, внутриклеточное распределение, стабилизация и деградация циклинов D-типа строго контролируются в нормальных клетках в ответ на включение/выключение митогенных сигналов. Сверхэкспрессия, накопление и нетипичная локализация циклинов D-типа приводят к опухолям человека и могут повышать устойчивость к химиотерапии [6]. Было отмечено, что нарушение регуляции циклина D1 при солидном раке наблюдается чаще, чем циклинов D2 и D3 [7]. Также было показано, что ген CCND1, кодирующий циклин D1, является вторым наиболее часто амплифицируемым локусом при солидном раке [8]. Имеются литературные данные о нарушении регуляции циклина D1 при раке молочной железы [9]. Однако связь между маркерами эпителиально-мезенхимальной трансформации и маркерами пролиферации, а также ее роль в развитии рака молочной железы до сих пор не изучены. Кроме того, в литературе имеются лишь единичные сведения об изучении маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода при незлокачественных пролиферативных заболеваниях молочной железы [10, 11], что, вероятно, связано со значительно меньшим числом оперативных вмешательств по поводу данной группы заболеваний. Фиброаденома, как правило, рассматривается лишь в качестве объекта с отсутствием экспрессии маркеров эпителиально-мезенхимальной трансформации при злокачественных опухолевых процессах [12], а не в качестве объекта для самостоятельного изучения. При этом сообщается об отсутствии при фиброаденомах клеток с признаками активации эпителиально-мезенхимального перехода [13].

Цель исследования: изучение экспрессии маркеров пролиферации циклина D1 и часто используемого в исследованиях маркера Ki-67, а также маркера эпителиально-мезенхимального перехода (фибронектина) в клетках инвазивной карциномы неспецифического типа и незлокачественных пролиферативных заболеваниях молочной железы.

Материал и методы исследования

Материалом служили биоптаты молочной железы 43 пациенток в возрасте 50 (41; 64) лет, 28 из которых имели инвазивную карциному неспецифического типа (ИКНТ) (у 13 пациенток отмечались метастазы с поражением 1–5 регионарных лимфатических узлов, у 15 пациенток метастазы выявлены не были), а у 15 – незлокачественные пролиферативные заболевания молочной железы ((НПЗ) (фиброаденоматоз – у 7 пациенток и фиброаденома – у 8). Неоадьювантная терапия ни одной из пациенток на момент исследования не проводилась.

Все исследования были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. От каждой пациентки получено информированное согласие на проведение исследования и получение образцов опухолей, подписанное самой пациенткой и заверенное врачом. Исследование одобрено комитетом по этике Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики подразделения Федерального исследовательского центра фундаментальной и трансляционной медицины (протокол № 2016-3).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии циклина D1, Ki67 и фибронектина проводили на парафиновых срезах опухолей с использованием следующих наборов антител и систем визуализации. Первичные антитела: кроличьи поликлональные антитела анти-Cyclin D1 (CCND1, PAA585Hu01, Сloud-clone corp.), мышиные моноклональные антитела анти-Fibronectin (IST-9, sc-59826, Santa Cruz Biotechnology), мышиные моноклональные антитела анти-Ki67 (Ki-67-MM1, Leica Biosystems). Для выявления на срезах первичных антител Cyclin D1 использовали систему визуализации Novocastra Peroxidase Detection System REF7120-K Leica Biosystems; для выявления первичных антител к фибронектину и Ki-67 использовали систему Novolink Polymer Detection System REF7120-K (Leica Biosystems).

Анализ экспрессии изучаемого маркера проводился с помощью морфометрического комплекса на базе микроскопа Микромед-6, цифровой камеры DSM 510 и программного обеспечения ImageJ 1.42g (Национальный институт здоровья, США). Для каждой пациентки оценивалось по 10 изображений (площадь каждого составляла 95578 мкм2). Подсчитывали абсолютное количество эпителиальных клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих соответствующий маркер, далее высчитывалось процентное содержание экспрессирующих клеточных элементов. Дополнительно экспрессию Ki67, циклина D1 и фибронектина определяли полуколичественным методом в соответствии со следующим стандартом оценки процента окрашивания клеток: 0–10% – 0 баллов; 11–25% – 1 балл; 26–50% – 2 балла; 51–75% – 3 балла, >75% – 4 балла. Те клетки, у которых оценка была меньше или равна 2 баллам, считались отрицательными, а те, у которых оценка была равна 3 или более, считались положительными [12].

Для статистической обработки результатов использовали программный пакет SPSS v 17.0 for Windows. Для сравнения двух независимых групп применяли критерий Манна–Уитни. Частота встречаемости эффекта при сопоставлении двух выборок осуществлялась с помощью критерия углового преобразования Фишера. Полученные в ходе исследования данные представлены как медиана (Me) и интерквартильный размах (Q1; Q3). Качество модели проверялось при помощи ROC-анализа.

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение № 075-15-2021-691).

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты морфометрического анализа экспрессии маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода отражены в таблице 1.

Таблица 1

Экспрессия маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода у пациенток со злокачественными и незлокачественными заболеваниями

Примечание: * – достоверные различия между группами НПЗ и ИКНТ; р1-2 – значение достоверности между группами НПЗ и ИКНТ

Обращает на себя внимание тот факт, что процентное соотношение клеток с экспрессией циклина D1 значительно превосходит аналогичный показатель, отражающий экспрессию широко используемого в клинической практике маркера пролиферативной активности – Ki67, что может объясняться большей чувствительностью данного метода для выявления клеток, находящихся в переходный период между пресинтетической (G1) и синтетической (S) фазами митоза.

При анализе группы пациенток с ИКНТ было отмечено, что пролиферативный потенциал опухолевых клеток у пациенток, имеющих метастазы в регионарных лимфатических узлах, и у пациенток без диагностированных метастазов колеблется в достаточно широких пределах (табл. 2), причем присутствуют как достаточно низкие значения, так и суперэкспрессия маркеров. Нужно отметить, что в данном исследовании мы не получили достоверных различий между показателями экспрессии маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимальной трансформации между подгруппами пациенток с ИКНТ, имеющих метастазы в регионарные лимфатические узлы, и при их отсутствии.

Таблица 2

Экспрессия маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода у пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа

Примечание: * – достоверные различия между подгруппами с наличием метастазов и без метастазов; р1-2 – значение достоверности между группами с наличием метастазов и без метастазов

Одной из причин этого может быть неодинаковая активность исследуемых маркеров при разных молекулярно-генетических подтипах рака молочной железы. Так, например, такая зависимость была установлена в ряде исследований для циклина D1 [14]. При этом авторы показали связь между усилением экспрессии этого маркера и количеством рецепторов к эстрогену.

Другой возможной причиной отсутствия различий между подгруппами пациенток с ИКНТ, имеющих метастазы в регионарные лимфатические узлы и без диагностированных метастазов, может быть достоверное различие в возрасте пациенток этих двух подгрупп (р=0,042). Так, возраст больных в подгруппе с наличием метастазов составил 45,0 (41,0; 58,5) лет, в подгруппе пациенток без метастазов – 60,0 (54,0; 68,0) лет. При сравнении показателей экспрессии изучаемых маркеров в одинаковых возрастных подгруппах (пациентки старше 50 лет), то есть по окончании детородного возраста и при снижении уровня эстрогенов, абсолютное количество клеток, экспрессирующих маркеры циклина и фибронектина, в более агрессивных опухолях (с наличием метастазов) достоверно отличается от соответствующих показателей опухолей без метастазов (табл. 3).

Таблица 3

Экспрессия маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода у пациенток с инвазивной карциномой неспецифического типа в возрасте более 50 лет

Примечание: * – достоверные различия между подгруппами с наличием метастазов и без метастазов; р1-2 – значение достоверности между группами с наличием метастазов и без метастазов

Так, абсолютное количество клеток с экспрессией циклина D1, играющего важную роль в контроле перехода G1/2-S в клеточном цикле и способствующего программе транскрипции и инициации синтеза ДНК, достоверно больше в подгруппе пациенток с наличием метастазов, то есть в более агрессивных на момент обследования опухолях. В то же время абсолютное количество клеток с экспрессией фибронектина достоверно больше у пациенток без метастазов. Учитывая, что активация эпителиально-мезенхимальной трансформации усиленно происходит на начальных этапах опухолевого роста [15], можно заключить, что большая активность данного процесса может быть вызвана именно периодом, предшествующим метастазированию, в ходе которого происходят потеря межклеточных контактов, перестройка цитоскелета, активация синтеза ферментов, способных приводить к деградации внеклеточного матрикса, что сопровождается синтезом продуктов, характерных для мезенхимальных клеток, но самого заселения опухолевых клеток в регионарные лимфатические узлы еще не произошло. Следовательно, это может свидетельствовать об имевшейся потенциальной угрозе метастазирования у пациенток, у которых на момент обследования не было выявлено метастазов в регионарных лимфатических узлах. Это подтверждается и тем наблюдением, что у всех пациенток, не имеющих на момент обследования метастазов в лимфатические узлы, но у которых была выявлена инвазия опухолевых клеток в лимфатические сосуды, а соответственно существовала исключительно высокая угроза развития метастазирования в дальнейшем, отмечалась суперэкспрессия фибронектина в пределах 99,1–99,6%. При этом у всех больных с ИКНТ, не имеющих ни метастазов, ни инвазии в лимфатические сосуды, процентное содержание клеток с экспрессией фибронектина никогда не достигало 99% (достоверность различия р=0,0095). В связи с этим являются целесообразными рекомендации исследования фибронектина в клинической практике для выявления группы пациенток с высокой вероятностью риска метастазирования в регионарные лимфатические узлы.

Результаты морфометрического анализа экспрессии маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода показали, что процентное соотношение клеток, экспрессирующих как маркеры Ki67 и циклина D1, так и маркер фибронектина, в группе пациенток с ИКНТ существенно выше, чем в группе пациенток с НПЗ. Это служило отражением не только повышенной пролиферативной активности клеток в группе пациенток со злокачественными новообразованиями, но и резкого усиления экспрессии фибронектина – маркера эпителиально-мезенхимальной трансформации. Экспрессия фибронектина в эпителиальных клетках свидетельствует о формировании атипии данных клеток.

Вместе с тем обращает на себя внимание тот факт, что в ряде случаев у пациенток с НПЗ не только отмечались единичные клетки с имевшей место экспрессией маркера эпителиально-мезенхимального перехода, но и выявлялось достаточно большое их количество (табл. 4). При этом у 5 пациенток (33,3% случаев НПЗ) содержание клеток, экспрессирующих фибронектин, превышало 50%, что позволило отнести этих пациенток в группу с положительным результатом иммуногистохимического окрашивания, причем у 3 из них (20,0% случаев НПЗ) содержание клеток, экспрессирующих фибронектин, было более 75%.

Таблица 4

Абсолютное количество клеток с экспрессией маркеров пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода и величины экспрессии иммуногистохимических окрашиваний

Примечание: * – достоверные различия между группами НПЗ и ИКНТ; р1-2 – значение достоверности между группами НПЗ и ИКНТ

При анализе морфометрических показателей 5 пациенток с НПЗ, отнесенных в группу с положительным результатом для иммуногистохимического маркера в эпителиальных клетках биоптата молочной железы, обращает на себя внимание, что эту группу составляли пациентки исключительно с фиброаденомой, в то время как в группу с отрицательным результатом для иммуногистохимического маркера входили пациентки как с фиброаденомой, так и с фиброаденоматозом (различия между группами р=0,0186). Характерным являлся и тот факт, что все исследованные случаи фиброаденомы смешанного типа относились к подгруппе с положительным результатом иммуногистохимического окрашивания. Не исключено, что активация эпителиально-мезенхимальной трансформации, которую отражает увеличение процентного соотношения клеток, экспрессирующих фибронектин, может служить неблагоприятным фоном для малигнизации НПЗ. Одним из косвенных доказательств существования такой возможности могут служить результаты ROC-анализа, представленные в таблице 5, которые демонстрируют отличное качество модели для подтверждения злокачественности процесса на основании оценки процентного содержания клеток с экспрессией фибронектина. При этом, если установить порог для процентного содержания фибронектина более 50% как соответствующий злокачественному новообразованию, то чувствительность данного метода будет равна 0,892, специфичность – 0,800, а точность, или доля «правильных срабатываний теста» среди всех обследованных, что является совокупным показателем информативности теста, – 0,860.

Таблица 5

Результаты ROC-анализа оценки процентного содержания клеток, экспрессирующих маркеры пролиферации и эпителиально-мезенхимального перехода

Заключение

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что имеются достоверные различия в экспрессии Ki-67, циклина D1 и фибронектина между пациентками со злокачественными новообразованиями и незлокачественными пролиферативными заболеваниями. Наиболее выраженными при этом являются различия экспрессии фибронектина.

Процентное соотношение клеток с экспрессией циклина D1 значительно превосходит аналогичный показатель, отражающий экспрессию широко используемого в клинической практике маркера пролиферативной активности – Ki67, что может трактоваться как большая чувствительность данного метода для выявления клеток, находящихся в переходный период между пресинтетической (G1) и синтетической (S) фазами митоза.

Наличие большого количества клеток с экспрессией фибронектина у пациенток с ИКНТ при отсутствии метастазов свидетельствует об активации эпителиально-мезенхимального перехода, который интенсифицируется на начальных этапах опухолевого роста, когда усиливается инвазивная способность опухолевых клеток, но самого заселения их в регионарные лимфатические узлы еще не выявлено. Характерным для пациенток, не имеющих на момент обследования метастазов в лимфатические узлы, но с выявленной инвазией опухолевыми клетками лимфатических сосудов, является суперэкспрессия фибронектина более 99,0%. В связи с этим можно рекомендовать исследование фибронектина в клинической практике для выявления группы пациенток с высокой вероятностью риска метастазирования в регионарные лимфатические узлы.

У 33% пациенток с незлокачественными пролиферативными заболеваниями молочной железы, в том числе с фиброаденомой, диагностировано положительное иммуногистохимическое окрашивание на фибронектин, в том числе у 3 пациенток отмечалось процентное содержание клеток, экспрессирующих данный маркер более 75%. Все исследованные случаи фиброаденомы смешанного типа относились к подгруппе с положительным результатом иммуногистохимического окрашивания. Не исключено, что активация эпителиально-мезенхимальной трансформации, которую отражает увеличение процентного соотношения клеток, экспрессирующих фибронектин, может служить неблагоприятным фоном для малигнизации незлокачественных пролиферативных заболеваний молочной железы.