Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

Патогенез ушиба сердца (УС) неразрывно связан с развитием стресса как неспецифического ответа организма человека и животных на воздействие любого значительного по силе или патогенного раздражителя [1]. Развитие общего и местного адаптационных синдромов, как известно, направлено на сохранение гомеостаза и формирование неспецифической резистентности организма по отношению к любому повреждающему фактору. При этом физиологические изменения (напряжение функциональных систем, перестройка метаболизма и др.) и поведенческие реакции в рамках стресс-реакции могут значительно варьировать в зависимости от индивидуальной реактивности, что, в свою очередь, способно существенно влиять на отдельные характеристики факторов повреждения и защиты в рамках патогенеза тупой травмы сердца. Отправной точкой любого исследования с этих позиций является оценка индивидуальной стрессовой реактивности.

В экспериментальной биологии и медицине существует множество методических подходов к оценке стрессовой реактивности, которые базируются на моделях, воспроизводящих стресс, и оценивают поведенческую стратегию животного в условиях воздействия стрессора [2]. Среди наиболее широко применяемых методик оценки стрессоустойчивости – различные модификации теста «Открытое поле» (Open field test) [3], теста «Принудительное плавание» (Porsolt forced swimming test, Behavioural Despair test) [4].

В основе теста принудительного плавания Порсолта лежит оценка поведенческой реакции экспериментального животного на угрозу утопления. Характер реакции позволяет судить о предрасположенности индивида к депрессивному настроению, а сам тест чаще всего используется для исследований в области психофармакологии. Однако в последнее десятилетие валидность теста и адекватность модели для оценки эффективности антидепрессантов подвергаются сомнению. Критическому анализу подвергается даже классическая интерпретация некоторых результатов теста. В частности, обсуждается вопрос о том, что собой представляет длительная неподвижность грызуна – поведенческий признак безнадежности и отчаяния или же, напротив, позитивный коррелят привыкания, адаптации [5]. Более того, в тесте Порсолта, особенно при высоте сосуда более 50 см, животные демонстрируют по крайней мере четыре различных паттерна плавания [Ошибка! Источник ссылки не найден.], что затрудняет интерпретацию результатов и ранжирование животных по стрессоустойчивости.

В тесте «Открытое поле» оценивается поведение (двигательная и ориентировочно-исследовательская активность) животного в новой, неизвестной для него обстановке. Тест позволяет исследовать врожденные особенности ориентировочно-исследовательского поведения и резистентности к стрессу по Холлу [6] и часто используется для проведения доклинических исследований фармакологических препаратов. В этом тесте снижение общей подвижности животных, замирание также трактуется как повышенный уровень стрессированности. Однако базовый постулат о том, что тест основан на противоречии между инстинктивным стремлением грызуна к исследованию нового и стремлением избежать потенциальной опасности в этой ситуации, также подвергается критике. Очевидно, что все животные модели имеют непреодолимые недостатки. Более того, сочетанное применение тестов нередко дает расхождение результатов [8], что ставит перед исследователем проблему выбора теста для конкретного исследования.

Не менее важный вопрос при разработке дизайна экспериментального исследования – определение объема выборки. Необходимость получения достоверных результатов исследования, с одной стороны, и неукоснительное соблюдение принципа гуманности в обращении с экспериментальными животными – с другой требуют корректного решения этого вопроса [9]. Таких исследований на модели ушиба сердца с учетом стрессоустойчивости ранее не проводилось.

Цель исследования – изучить возможность сочетанного применения поведенческих тестов для определения стрессоустойчивости крыс и методики расчета минимального размера выборки на модели экспериментального ушиба сердца.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на 216 белых аутбредных крысах-самцах массой 250–300 г с соблюдением правил проведения работ и содержания животных (приказ Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики»). Получено разрешение локального этического комитета ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России на проведение исследования, включая все этапы эксперимента. На инвазивных этапах эксперимента использовался общий анестетик Золетил 100 (Zoletil 100, Virbac Sante Animale, Франция) в дозе 30 мг/кг внутрибрюшинно.

Оценка стрессоустойчивости крыс проводилась при помощи теста принудительного плавания Порсолта (ПП) и теста «Открытое поле» (ОП). Тест принудительного плавания проводился с грузом 10% веса животного в прозрачном сосуде высотой 80 см при температуре воды 30±1°С. Определение стрессоустойчивости проводилось по времени плавания [10].

Через 72 часа после принудительного плавания с грузом проводили тест «Открытое поле» в круглой арене белого цвета, разделенной на 37 секторов, в течение 3 минут. Для облегчения подсчета показателей проводилась видеозапись. В ходе теста фиксировали следующие показатели: горизонтальная двигательная активность (ГДА), вертикальная двигательная активность (ВДА), латентный период (ЛП) первого движения, время замираний по ходу движения, время выхода в центр арены. По результатам теста рассчитывали коэффициент стрессоустойчивости [3, 11] и применяли методы статистической классификации. По результатам каждого теста животные разделялись на 3 категории: низкоустойчивые (НУ), высокоустойчивые (ВУ) и среднеустойчивые (СУ).

Через 10 дней после ранжирования крыс по стрессоустойчивости формировали по 3 соответствующие подгруппы (НУ, СУ и ВУ, по 8 особей в каждой) в контрольной группе и в трех опытных группах: моделирование ушиба сердца (УСО), моделирование ушиба сердца на фоне применения агониста опиатных рецепторов даларгина (УС+Д) и моделирование ушиба сердца на фоне применения блокатора минералокортикоидных рецепторов эплеренона (УС+Э). Ушиб сердца в опытных группах воспроизводили при помощи оригинального устройства [Ошибка! Источник ссылки не найден.], имитирующего удар передней грудной стенки о стойку руля при столкновении движущегося автомобиля с препятствием. Животное фиксировали в вертикальном положении на подвижном устройстве в виде тележки, приводимой в движение падающим грузом. В конце пути следования тележки располагалось препятствие (щиток из дерева), имеющее выступ, площадь которого есть площадь удара с передней грудной клеткой животного при столкновении. В модели предусмотрена техническая возможность предварительного смещения (вверх/вниз) препятствия для приведения в соответствие уровня препятствия с областью проекции сердца на грудную клетку. Даларгин вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг за 2 часа до введения в наркоз, непосредственно перед травмой и через 2 часа после моделирования ушиба сердца. Эплеренон вводили энтерально в дозе 100 мг/кг в сутки на протяжении 10 дней, предшествующих моделированию УС.

Для оценки стресс-реакции и корректности ранжирования животных по стрессоустойчивости через 1 сутки после моделирования ушиба сердца оценивали в плазме крови уровень кортикостерона методом ИФА и содержание глюкозы при помощи тест-систем компании «Ольвекс» (Россия). Выраженность оксидативного стресса в поврежденном сердце оценивали по содержанию в гомогенатах миокарда восстановленного глутатиона (GSH) и общей антиоксидантной способности (TAS) при помощи тест-систем ELISA Kit фирмы Cloud-Clone Сorp. (Китай). Реакцию системы крови оценивали по общему содержанию лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов. Исследование проводилось на гематологическом анализаторе Mindray BC-3000Plus (Китай) и в мазках крови, окрашенных по Романовскому–Гимзе. Расчет минимального объема выборки проводили при помощи онлайн-калькулятора [12].

Статистическая обработка данных осуществлялась методами описательной статистики, сравнение двух независимых выборок проводилось при помощи U-критерия Манна–Уитни. Уровень статистической значимости принят равным 0,05. Корреляционный анализ переменных проводился при помощи коэффициентов Спирмана и Кендалла. Для ранжирования животных в тесте «Открытое поле» применялся иерархический кластерный анализ методом внутригрупповой связи со стандартизацией показателей. Обработка данных проводилась с использованием программы IBM SPSSStatistics23.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе в исследование вошли 130 крыс. Они были ранжированы в тесте ПП по времени плавания методом разделения выборки на квартили. Высокоустойчивыми считали животных, показавших наибольшее время плавания, – находящихся ниже 3-го квартиля. К низкоустойчивым отнесли животных, находящихся выше 1-го квартиля. Остальных считали среднеустойчивыми. При формировании группы со средней устойчивостью к стрессу столкнулись с проблемой недостаточного различия между группами, которая была частично решена сокращением группы среднеустойчивых животных наполовину, в результате получили 3 равные по численности подгруппы – по 32 ВУ, СУ и НУ животных.

При оценке стрессоустойчивости при помощи теста ОП использовался коэффициент стрессоустойчивости (индекс активности). Для его расчета сумму горизонтальной и вертикальной двигательной активности делили на сумму латентного периода выхода из центра арены и времени выхода в центр [11]. В результате наибольшее количество животных пришлось на низкоустойчивых, а наименьшее – на высокоустойчивых. Такое неравномерное распределение осложняет формирование экспериментальных групп для исследований по показателю стрессоустойчивости.

Рис. 1. Распределение животных (%) по стрессоустойчивости в тесте «Открытое поле»

Далее было проведено сравнение переменных, полученных при проведении двух поведенческих тестов, с целью поиска зависимости между показателями и для оценки взаимозаменяемости этих тестов [14]. Корреляционный анализ не выявил значимой связи между переменными в тесте ОП и временем плавания. Коэффициенты корреляции Спирмена и Кендалла колебались в диапазоне от –0,18 до 0,12. Этот факт подтверждает, что тесты ПП и ОП оценивают различные компоненты стрессовой реакции и не могут заменить друг друга. Тест ПП воспроизводит и оценивает сочетание эмоционального стресса и стресса физической нагрузки, причем высокой интенсивности, тогда как тест ОП оценивает исключительно эмоциональный компонент стресса, причем относительно невысокой интенсивности. Совместное применение этих тестов может помочь ранжировать животных с опорой на больший набор характеристик стрессовой реактивности.

С этой целью была предпринята попытка объединить результаты тестов и сформировать группы по стрессоустойчивости из животных, показавших одинаковый уровень стрессоустойчивости в обоих тестах, однако процент совпадений между тестами по оценке стрессоустойчивости оказался слишком низким, особенно в группе высокоустойчивых животных.

Рис. 2. Распределение животных (%) по стрессоустойчивости в тестах «Открытое поле» и «Принудительное плавание» на первом этапе исследования. Зоны совпадения результатов двух тестов отмечены белыми точками на цветном фоне

В связи с этим было принято решение на первом этапе исследования использовать только тест ПП, но увеличить различия между ВУ, СУ и НУ животными за счет выбросов и включить в подгруппы по 16 животных каждой категории стрессоустойчивости. Уменьшение численности групп в 2 раза позволило увеличить различия во времени плавания в группах практически в 3 раза (табл. 1).

Таблица 1

Время плавания животных в тесте «Принудительное плавание»

В результате получены убедительные данные (рис. 3), отражающие статистически значимые различия по всем стресс-ассоциированным биохимическим показателям между опытной (УСО) и контрольной группами, а также между подгруппами с различной стрессоустойчивостью в пределах группы УСО [15, 16].

Рис. 3. Биохимические и гематологические показатели крыс с различной стрессоустойчивостью через 24 часа после моделирования ушиба сердца: а – кортикостерон (плазма крови, нг/мл); б – глюкоза (плазма крови, ммоль/л); в – лейкоциты (кровь, 10^9л-1); г – нейтрофилы (кровь, 10^9л-1); д – восстановленный глутатион (миокард, мкг/мл); е – общая антиоксидантная способность (миокард, ммоль/мг); – статистически значимые различия в сравнении с группой УСО; е – статистически значимые различия между подгруппами по стрессоустойчивости

Так, содержание кортикостерона и глюкозы показало статистически значимые различия между ВУ, СУ и НУ животными опытной группы; при оценке оксидативного стресса в ткани миокарда травмированных животных выявлены различия между ВУ и НУ к стрессу животными. Полученные данные свидетельствуют о том, что, во-первых, стресс-ассоциированные показатели в посттравматическом периоде УС различаются в зависимости от исходной стрессоустойчивости экспериментальных животных, а, во-вторых, ранжирование крыс по времени плавания с грузом позволяет сформировать подгруппы с различной стрессовой реактивностью. Примечательно, что различия в уровнях кортикостерона и глюкозы в плазме крови выявляются только в состоянии стресса, сопряженного с тупой травмой сердца. В контрольной группе статистически значимых различий этих показателей между животными с различной стрессоустойчивостью не обнаружено.

Для расчета минимального размера выборки были рассчитаны медианы, средние значения и стандартные отклонения по ключевым показателям в группах сравнения. На основе этих данных при помощи онлайн-калькулятора [12] был рассчитан минимальный объем выборки. Сравнивались контрольные и опытные группы с одинаковыми характеристиками стрессоустойчивости, а также проводилось исследование внутри опытной группы между подгруппами с различной стрессоустойчивостью. Обобщенные данные о минимальном количестве животных в подгруппах с различной стрессоустойчивостью по каждому исследуемому показателю (табл. 2) позволяют сделать вывод: несмотря на небольшое колебание размера выборки в большую или меньшую сторону, 8 животных в среднем достаточно для исследования выбранных переменных.

Таблица 2

Расчетный размер выборки в контроле и опыте для каждой отдельной подгруппы крыс с различной стрессоустойчивостью по исследуемым показателям

В соответствии с задачами исследования на втором этапе изучалось влияние агониста опиатных рецепторов и блокатора минералокортикоидных рецепторов на течение посттравматического периода УС у крыс с различной стрессоустойчивостью. Для выполнения этой задачи необходимо было сформировать еще 2 группы с фармакологической модуляцией, причем с представительством в каждой из них животных трех подгрупп с различной стрессоустойчивостью. Таким образом, суммарно нужно было сформировать еще 6 подгрупп по 8 животных в каждой. С этой целью к ранжированным, но не вошедшим в исследование на первом этапе, необходимо было добавить определенное количество животных для комплектации подгрупп опытных групп численностью 8 особей каждая. С этой целью ранжированию были подвергнуты еще 86 крыс.

Для повышения чувствительности ранжирования животных на этом этапе использовались оба теста (ПП и ОП), причем способ оценки стрессоустойчивости в открытом поле был изменен. Основанием послужили наблюдение, сделанное на первом этапе эксперимента, а также данные литературы об обоснованности применения кластерного анализа (а не конкретного коэффициента) для ранжирования крыс по стрессоустойчивости в тесте «Открытое поле» [17, 18], что не усложняет процесса проведения эксперимента благодаря доступности вычислительной техники. Суть наблюдения заключается в том, что показатель «время выхода в центр арены» оказывает слишком большое влияние на коэффициент стрессоустойчивости – часть животных все время бегает по периферии и не выходит в центр.

В связи с этим было принято решение использовать методы статистической классификации для разделения животных по данным теста «Открытое поле», заменив при этом показатель времени выхода в центр арены на время замираний по ходу движения. Этот показатель в литературе считается признаком страха и низкой устойчивости к стрессу у крыс [19]. Разделение животных по стрессоустойчивости на 3 подгруппы осуществлялось при помощи иерархического кластерного анализа методом внутригрупповой связи. Учитывая неоднородность переменных, была применена стандартизация данных методом z-оценки.

В результате были получены 3 достаточно близкие по численности подгруппы (рис. 4), корректность разделения на которые была проверена при помощи критерия Манна–Уитни. При этом выявлены статистически значимые различия (p<0,05) между полученными подгруппами по показателям горизонтальной двигательной активности, вертикальной двигательной активности и времени замирания. Число пересечений в оценке результатов по двум тестам в пределах одной подгруппы получилось близким во всех подгруппах и составило около 30–39%, а крыс, получивших идентичную оценку в обоих тестах, оказалось достаточно для нужд второго этапа исследования.

Рис. 4. Распределение животных (%) по стрессоустойчивости в тестах «Открытое поле» и «Принудительное плавание» на втором этапе исследования. Зоны совпадения результатов двух тестов отмечены белыми точками на цветном фоне

Таким образом, для второго этапа исследования были отобраны по 8 животных каждого типа стрессоустойчивости (подгруппы ВУ, СУ, НУ) в опытные группы УС+Д и УС+Э. Результаты биохимических и гематологических исследований обнаружили статистически значимые различия между опытными группами с применением препаратов (УС+Д и УС+Э) и без фармакологического вмешательства (УСО), а также частично сохранились различия исследованных показателей между подгруппами ВУ, СУ и НУ животных внутри каждой из групп УС+Д и УС+Э (рис. 3).

Эти данные подтверждают обоснованность сочетанного применения поведенческих тестов для ранжирования нелинейных крыс с учетом индивидуальной стрессоустойчивости в условиях экспериментального ушиба сердца. Вероятно, подобная методика применима для изучения роли индивидуальной стрессовой реактивности и на других моделях.

Заключение

Сочетанное применение теста «Принудительное плавание» с грузом и теста «Открытое поле» в предложенной модификации позволяет отобрать животных с самыми ярко выраженными поведенческими характеристиками стрессоустойчивости и, как следствие, формировать группы аутбредных крыс с различной стрессовой реактивностью. Эффективность методики подтверждается полученными на модели ушиба сердца статистически значимыми различиями по ряду аффилированных со стрессом биохимических и гематологических показателей в зависимости от исходной стрессоустойчивости животных через сутки после травмы, в том числе в условиях фармакологической коррекции.

Медиана, средние значения и стандартные отклонения аффилированных со стрессом показателей в группах сравнения с использованием онлайн-калькулятора позволяют рассчитать минимальный объем выборки для выявления различий в течении посттравматического периода экспериментального ушиба сердца, обусловленных индивидуальной стрессоустойчивостью.