Начало XXI в. ознаменовано успехами по многим направлениям российской медицины, в том числе и фтизиатрии, что во многом обусловлено выполнением соответствующих государственных программ. Однако широкое распространение туберкулеза легких, ежегодно приводящее к длительной потере нетрудоспособности и даже инвалидизации десятков тысяч работоспособных граждан нашей страны, до сих пор остается злободневной проблемой как в медицинской, так и в общегосударственной сферах [1, 2, 3, 4].
В этом аспекте выявление новых неселективных маркеров туберкулезного процесса, а также разработка на их основе оригинальных и простых биохимических тестов, способных оптимизировать стандартные схемы диагностики, прогноза и адекватного анализа качества лечения туберкулеза легких, безусловно, являются насущными задачами современной фтизиатрии.
Наиболее привлекательным в этом плане, на наш взгляд, является альфа2-макроглобулин (МГ) – тяжелый гликопротеид плазмы крови человека (молекулярная масса 820 кД), известный как острофазовый маркер. Кроме того, его уровень повышается у нефротических больных, у пациентов с псориазом, отторжением трансплантата, а снижение концентрации этого белка в сыворотке крови отмечается при панкреонекрозе, массивных ожогах, остеоартрозе ревматического генеза, вирусном гепатите [5, 6, 7].
По данным многих авторов, являясь активным ингибитором большинства известных протеолитических ферментов, МГ выполняет функцию выраженного иммуносупрессора, причем на уровне как клеточного, так и гуморального иммунитета [7, 8]. Основываясь на этих сведениях, мы выдвинули предположение, что такая патология, как туберкулез легких, довольно часто сопровождающаяся снижением иммунного статуса, может стимулировать индукцию гена МГ и, следовательно, приводить к достоверным изменениям уровня данного белка.
Цель исследования: создание, клиническая апробация и оценка диагностической значимости иммунохимического теста на альфа2-макроглобулин для диагностики туберкулеза легких.
Материалы и методы исследования
В качестве материала в данном исследовании использовали сыворотку крови больных различными формами туберкулеза легких, которую получали в ГБУЗ АО «Областной клинический противотуберкулёзный диспансер» (клинический материал), а также человеческую плазму (в контрольной группе), получаемую в Астраханской областной станции переливания крови. Следует отметить, что для исследования брали материал только от больных с активным туберкулезным процессом, т.е. от пациентов с выраженной клинической картиной, манифестными данными рентгенографии и компьютерной томографии (КТ) легких, положительной реакцией на «Диаскинтест» и уровням С-реактивного белка (СРБ) не ниже 50 мг/л.
Всего исследовано 390 проб, из них: 336 образцов крови от 126 пациентов с туберкулезом легких и 54 – от доноров (табл. 1).
Таблица 1
Перечень материала по группам
|
Материал |
Образцы (n) |
Пациенты (n) |
|
Туберкулез легких: очаговый туберкулез инфильтративный туберкулез диссеминированный туберкулез фиброзно-кавернозный туберкулез |
336 112 97 53 74 |
126 44 37 19 26 |
|
Доноры (группы сравнения) |
54 |
54 |
|
Всего |
390 |
180 |
Проведено исследование 48 пациентов в динамике: на момент поступления в стационар, на 3-й месяц и по окончании интенсивного курса терапии (144 пробы) с позитивными результатами лечения, качество которого оценивали по нормализации клинических, рентгенологических и лабораторных данных.
Объем поражения легких, определяемый методом компьютерной томографии органов грудной клетки, вычислялся по авторской разработке как отношение количества пораженных сегментов к общему их числу – 19, которое затем переводили в проценты от общего объема легочной паренхимы. Пример: если у пациента обнаруживали патологические зоны активного туберкулеза, занимавшие в одном сегменте четверть объема, а в другом – половину, то общий объем поражения рассчитывался следующим образом: (1/4 + 1/2) / 19 х 100 = 3,95%.
Для очистки МГ применяли методы высаливания белков исходного материала (сыворотка крови беременных женщин (38–40 недель), доставляемая из ГБУЗ АО «Клинический родильный дом», Астрахань) сернокислым аммонием 40%-ного насыщения, анионообменной хроматографии на сефадексе типа DEAE А-50 в 0,01 М трис-HCl, рН 7,1 буфере а гель-проникающую хроматографию проводили на Toyopearl-65 с использованием 0,14 М фосфатного буфера, рН 7,3.
Моноспецифические поликлональные антисыворотки на МГ получали иммунизацией кроликов породы «шиншилл» дробными дозами очищенного препарата МГ подкожно, в 4–5 точек в районах лимфоузлов, по следующей схеме: 4 введения с 5-дневными интервалами смеси антигенного материала с 2,5 мл полного адьюванта Фрейнда, 3 мг убитых туберкулезных палочек и 0,5 мл физраствора. Антиген вводили в возрастающих дозах: 12 – 24 – 48 – 64 мг. Контроль качества полученных антисывороток к МГ проводили методами иммунопреципитации и иммуноэлектрофореза. Титры полученных гипериммунных моновалентных антисывороток, определенные методом радиальной иммунодиффузии, составили 1/128.
Определение концентраций МГ как в очищенных препаратах, так и в клиническом материале проводили методом ракетного электрофореза на 1% на 0,05 М веронал-мединаловом буфере рН-8,6 с додецилсульфатом натрия (ДСН) в авторской модификации [9, 10]. Порог чувствительности метода устанавливали по минимальной концентрации МГ в стандартной пробе, при которой еще визуально определялись электрофоретические пики. Уровень искомого протеина определяли с помощью калибровочной кривой, построенной на основании усредненных значений высоты пиков разгона проб с известной концентрацией МГ (от 0,5 до 1500 мг/).
Для оценки диагностической значимости разработанного теста на МГ использовали альтернативный тип референтной оценки с применением количественного результата трактовки. Дискриминантная концентрация (точка разделения) определялась как сумма средних числовых значений уровня МГ в контрольной группе и трехкратного среднеквадратического отклонения (М±3σ) по каждой из референтных групп. Чувствительность теста определялась как процент числа истинно положительных от суммы истинно положительных и ложноотрицательных результатов; специфичность – как процент числа истинно отрицательных от суммы ложноположительных и истинно отрицательных выявлений; воспроизводимость – как процент сходных значений (не выше ±σ) при повторных определениях идентичных проб; диагностическая эффективность – как половина суммы значений чувствительности и специфичности теста.
Статистический анализ полученных данных проводили при помощи лицензионного пакета Excel-2019 (Microsoft) с использованием общепринятых показателей: М (средняя величина), m (среднее отклонение), р (значимость различий), t (критерий Стьюдента), r (корреляционный коэффициент Пирсона), а также F (критерий Фишера) для дисперсионного анализа по клиническим выборкам.
Результаты исследования и их обсуждение
Настоящее исследование проводилось с 2017 по 2020 гг.
В ходе работы смоделирован новый алгоритм получения очищенного препарата МГ, включающий три простых и эффективных этапа: высаливание белковых компонентов исходного биоматериала добавлением (NH4)2SO4 до 40%, анионообменное хроматографическое выделение на сефадексе типа DEAE А-50 с 0,01 М трис-HCl в качестве элюэнта при рН 7,1 с элюцией в нисходящем ступенчатом градиенте рН, а также гель-фильтрация на Toyopearl-65 с элюцией в 0,14 М фосфатном буфере при рН 7,3.
Степень чистоты препарата МГ, определяемая как процент его абсолютных средних величин (мг/л) к таковым по общему белку в очищенных препаратах, составила 84,31±2,8%, что соответствовало степени очистки в 73,4±2,4 раза.
На основе полученных самостоятельно специфических антисывороток к МГ и очищенного препарата этого белка разработан оригинальный иммунохимический тест на МГ с порогом чувствительности 1,63±0,08 мг/л (р<0,005). Анализ многократных повторных определений уровня МГ в стандартных пробах очищенного препарата показал его высокую воспроизводимость – 97,2%.
Предлагаемый способ количественного определения МГ в сыворотке крови основывается на методе ракетного электрофореза в авторской модификации, заключающейся в добавлении ДСН в исследуемые пробы (до 2% концентрации). Как показал эксперимент, будучи активным анионным детергентом, ДСН увеличивает заряд белковых молекул, в том числе и МГ, и тем самым значительно повышает электрофоретическую подвижность этого «тяжелого» белка. Данной манипуляцией достигаются два позитивных эффекта, являющихся безусловным преимуществом теста: во-первых, существенно сокращается время проведения электрофоретического анализа (с 1,5 ч до 45–50 мин), во-вторых, увеличивается длина пиков преципитации, что повышает точность определения концентрации МГ.
Проведена широкая клиническая апробация иммунохимического теста на МГ в представленных выборках клинического материала (табл. 2).
Таблица 2
Результаты количественного определения МГ в выборках
|
Исследуемые клинические группы |
n
|
Концентрация МГ (мг/л) |
Критерий Стьюдента (t) |
Коэффициент дисперсии (F) |
|
Очаговый туберкулез |
112 |
815,8±32,24 |
4,14 р<0,05 |
5,1 |
|
Инфильтративный туберкулез |
97 |
857,4±28,16 |
5,32 р<0,01 |
5,4 |
|
Диссеминированный туберкулез |
53 |
982,3±35,27 |
5,63 р<0,01 |
6,2 |
|
Фиброзно-кавернозный туберкулез |
74 |
739,1±30,48 |
4,75 р<0,05 |
4,9 |
|
Здоровые |
54 |
318,2±22,13 |
– |
– |
|
Всего |
390 |
|
|
|
Математический сравнительный анализ сопоставляемых парных средних по клиническим выборкам по отношению к результатам в группе сравнения, а также уровней дисперсии показал высокую статистическую значимость в исследуемых выборках. Различия средних концентраций МГ между всеми клиническими группами и контрольной группой оказались достоверными (р<0,05).
Выявлена высокая прямая корреляция между средними значениями МГ в каждой выборке и соответствующими средними объемами поражения паренхимы легких активным туберкулезным процессом (без учета фиброзных изменений), что свидетельствует о значимости МГ как маркера активного туберкулеза легких (табл. 3).
Было также проведено количественное определение уровня МГ в динамике у пациентов с позитивным течением патологического процесса, свидетельствующим об успешности проводимого лечения. В представленных клинических группах исследование показало удовлетворительные значения обратной корреляции между концентрацией МГ и сроками терапии (за исключением больных с фиброзно-кавернозной формой, где величина r оказалась на грани достоверности) (табл. 3).
Таблица 3
Анализ корреляционных отношений по группам
|
Исследуемые группы |
Корреляция (r) уровня МГ с объемом поражения легких |
Корреляция (r) уровня МГ с течением процесса в ходе лечения |
|
Очаговый туберкулез |
0,76 |
–0,72 |
|
Инфильтративный туберкулез |
0,78 |
–0,85 |
|
Диссеминированный туберкулез |
0,74 |
–0,69 |
|
Фиброзно-кавернозный туберкулез |
0,72 |
–0,42 |
Данный факт свидетельствует о безусловной ценности МГ как маркера качества лечения.
На наш взгляд, выраженное повышение среднего уровня МГ у больных туберкулезом легких объясняется ключевой ролью этого белка в формировании иммунного статуса человека, что было показано нами ранее [8]. Неудивительно, что, будучи выраженным иммуносупрессором, этот протеин чутко реагирует на активный туберкулезный процесс, который, как правило, развивается на фоне подавленного иммунитета. Если учесть активную роль МГ в формировании иммунологической толерантности беременных женщин [8], не исключено, что этот белок также участвует в процессах иммунологической супрессии при туберкулезе легких. Снижение средних значений МГ в сыворотке крови пациентов в процессе успешного лечения тоже укладывается в данную гипотезу.
На заключительном этапе исследования проведена оценка качества теста на МГ как нового диагностическо-прогностического инструмента для фтизиатрии с учетом альтернативной количественной характеристики результатов. Расчет дискриминантной концентрации дал значение 371±34,6 мг/л. Анализ диагностической значимости предлагаемого теста на МГ по основным показателям дал следующие результаты: чувствительность – 95,8%; прогностичность отрицательного результата – 79,4%; диагностическая эффективность – 97,9%; специфичность – 100%; прогностичность положительного результата – 100%.
Данные результаты объясняются полным отсутствием ложноположительных срабатываний и доказывают клинико-лабораторную ценность нового теста на МГ.
Заключение
Включение нового селективного, чувствительного, воспроизводимого и эффективного иммунохимического теста на альфа2-макроглобулин в стандартную панель диагностики и оценки течения туберкулеза легких в качестве дополнительного параметра, несомненно, облегчит клинико-диагностический мониторинг данной патологии.
Библиографическая ссылка
Кривенцев Ю.А., Даутов И.Б. НОВЫЙ ТЕСТ НА АЛЬФА2-МАКРОГЛОБУЛИН В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ // Современные проблемы науки и образования. – 2022. – № 2. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=31585 (дата обращения: 16.04.2024).