Показателями интенсивности разложения трупа являются качественные и количественные характеристики его микрофлоры или некробиома. Труп является доступным источником азотсодержащей органики для микроорганизмов [1; 2], которые используют его в качестве источника питания и могут оказывать большое влияние на направленность разложения [3; 4]. Кроме того, доминантные эколого-трофические группы микрофлоры трупа представляют особый интерес для судебной экспертизы, поскольку способны выживать и расти благодаря активной конкуренции с некрофильными насекомыми, представляющими экологический комплекс деструкторов останков и экскрементов животного происхождения [5].
Целью работы являлось изучение специфики микробного разложения мертвых тел.
Материал и методы исследования. Для проведения исследования пробы отбирали из трупов домашних свиней (массой 50-100 кг), кур (массой 1,5-2 кг) и домовых мышей (массой 80 г). Всего изучено более 80 объектов, более 1000 изолятов микроорганизмов. Все эксперименты проводились с соблюдением соответствующих этических норм и правовых документов.
Микрофлору ложа и фрагментов органов и тканей трупа отбирали из наиболее подвергающихся микробной контаминации областей и в условиях асептики помещали в пробирки со стерильной транспортной средой. С костных останков трупов свиней посмертную микрофлору отбирали методом смывов. Методика сбора и микробиологического анализа смывов позволяет получить более точные результаты и определить присутствие характерных микроорганизмов в составе микрофлоры трупа. Смывы (протирая необходимые участки не менее 5 раз) собирали стерильными салфетками или ватными тампонами, которые предварительно смачивали стерильным изотоническим раствором. Параллельно измерялась температура трупа и окружающей его среды. Параллельно с отбором проб измеряли температуру и кислотность тканей трупа и окружающей среды.
Для выделения и идентификации Firmicutes и Gracilicutes использовали диагностические наборы «Микро-Желатиназа-Ницф», «Микро-Гинс-Ницф», «Микро-Циль-Нильсен-Ницф», «Микро-Каталаза-Ницф», «Микро-Цитохромоксидаза-Ницф», среды Блаурокка и Китт-Тароцци, короткий ряд Гисса, сульфатредуцирующий агар. Таксономическая идентификация производилась с использованием алгоритма определения вида по «Определителю бактерий Берги» (1997) [6].
Последовательную смену микроорганизмов некробиома изучали в естественных условиях и на антропогенно измененных территориях, оценивали по динамике эколого-физиологических профилей: протеолитиков, целлюлозолитиков, азотфиксаторов, прототрофов и сульфатредукторов. Дополнительно для них определяли и биохимические показатели.
Для изучения консорциума аммонификаторов посмертного микробиома использованы стандартные среды, реактивы и красители. Основными признаками их развития считали помутнение среды, образование пленки, осадка и положительные реакции на аммиак (NH3) с реактивом Несслера и на сероводород (H2S) с ацетатом свинца. Наблюдения проводили на первые, третьи, пятые и седьмые дни с момента посева. Реакцию на NH3 ставили на пятый-седьмой день. Морфологию и ультраструктуру клеток аммонификаторов учитывали на препаратах, выполненных по Граму, а разнообразие их определяли по культуральным макро- и микроскопическим признакам. Доминантные колонии с наиболее специфическими признаками исследовались бактериоскопически с помощью окраски по Граму.
Протеолитическую активность и свойства представителей доминантных видов посмертного микробиома, выделенных в чистую культуру, рассматривали на разных стадиях разложения трупов. При интерпретации полученных данных учитывали основные абиотические показатели на момент отбора проб.
С целью изучения многообразия физиологических групп микроорганизмов, ответственных за трансформацию костных останков, использован труп экспериментального животного, который помещали в природные условия для развития явлений гниения. Для наблюдения за интенсивностью разложения трупа и изменениями костной ткани проводился макроскопический анализ, в процессе которого фиксировались интенсивность гнилостной трансформации трупа, а затем и костных останков – наличие или отсутствие на костях мягких тканей, их цвет и структура, состояние костной пластинки, тяжесть, плотность и маслянистость костей. С помощью прибора «4В1 PН метра» оценивали изменение абиотических факторов в почве и трупе: морфологические и физико-химические свойства (кислотность, влажность, температура).
Затем кости в условиях лаборатории помещали в огородную почву с целью создания эффекта «почвенной ловушки» для участвующих в разложении костной ткани микроорганизмов. Опыты проводили при температурах +37, +21 и +5 °С. Микрофлору отбирали методом смывов стерильными тампонами, рандомно от 3 до 5 образцов. Микробиологический анализ осуществляли сразу после отбора проб путем суспензирования в физиологическом растворе, затем, в объеме 0,1 мл, инокулирования в среды, предназначенные для развития узких групп микроорганизмов, выполняющих определенную функцию в процессе диагенеза костных останков.
Для преимущественного выделения из образцов спорообразующих аммонифицирующих бактерий предварительно проводили их пастеризацию с целью гибели вегетативных клеток и сохранения только спорогенных организмов. Накопительные культуры получали при температурном диапазоне от 24±3 до 37±1 °С. Учет количества представителей определенной физиологической группы проводили методом предельных разведений с использованием таблицы Мак-Креди.
Для изучения процессов биогенной деструкции коллагена костной ткани проведена серия экспериментов по выделению в чистую культуру коллагеназ-продуцирующих бактерий родов Bacillus и Clostridium с использованием модифицированного метода агаровых блоков Н.С. Егорова [7]. Одновременно оценивали протеолиз желатины (60% гидролизата коллагена). Бактерии, обладающие ферментом желатиназой, подвергают гидролизу аминокислоты, входящие в состав желатина, в результате чего этот белок теряет свои желирующие свойства, приобретая жидкую консистенцию. Приготовление питательной среды для определения желатиназной активности выполняли с помощью набора реагентов «Микро-Желатиназа-Ницф» (021231): ГМФ бульон – 3,0; желатин – 12,0; Na2CO3 – 2,0. Чистые 18-часовые тест-культуры засевали уколом в пробирки с питательным желатином и помещали в термостат при +37±0,5 °С на 3–5 суток, перед учетом результатов посевы выдерживали в холодильнике 30 минут при температуре +3,0±2 С вместе с неинокулированной контрольной пробой. В случае с положительной желатиназной активностью отмечали расплавление желатина, а при отрицательной реакции – отсутствие расплавления.
Результаты и их обсуждение. Практически любое микробное сообщество представлено эукариотическими (грибы, микромицеты, дрожжеподобные грибы, простейшие) и прокариотическими (истинные бактерии, архебактерии, эубактерии, риккетсии и хламидии) организмами. В нашей работе исследованы представители мира прокариот, а именно эубактерии, так как именно они занимают доминирующее положение в контролирующем путрификацию сообществе.
В результате исследований по таксономическому разнообразию некробиомов получены данные о зависимости количества и качества идентифицированных таксонов Firmicutes и Gracilicutes от вида экспериментального животного, размеров трупа, биотопа его расположения, а также интенсивности и сроков разложения. Наибольшее разнообразие прокариотических микроорганизмов характерно для трупов свиней, некробиом которых содержал 24 рода фирмикутных и 14 родов грациликутных бактерий. Активные аммонификаторы среди них были представлены 5 родами. Наименьшее разнообразие вышеуказанных бактерий установлено для трупов куриц – 19 родов, из которых к активным аммонификаторам отнесены 4: Bacillus, Enterococcus, Clostridium, Pseudomonas. Полученные данные свидетельствуют об относительной стабильности ведущей микрофлоры, ответственной за процессы аммонификации (разложения) белков в составе трупного материала.
В результате исследования эколого-трофического разнообразия микроорганизмов в составе микрофлоры трупа выделены пять эколого-трофических групп, принимающих активное участие в разложении мертвого вещества: протеолитики, целлюлозолитики, азотфиксаторы, прототрофы, сульфатредукторы. В составе исследуемых микробных сообществ не выявлено олигонитрофилов и олигокарбофилов, что означает незавершенность процессов микробной минерализации органического вещества к 58 суткам разложения трупного материала. Каждую эколого-трофическую группу представляли таксоны микроорганизмов, которые имеют определенный набор ферментов, активирующийся на ранней или на поздней стадии разложения трупа.
Для описания динамики численности и структуры доминантных видов микроорганизмов в разные периоды разложения трупа выполнено распределение видов по шести жизненным формам: анаэробные хемоорганотрофы; аэробные хемоорганотрофы; аэробные хемоорганотрофы, активные аммонификаторы; факультативные анаэробы; хемоорганотрофы, денитрификаторы; аэробные фиксаторы молекулярного азота; аэробные аутотрофы, окисляющие аммиак до азотистой кислоты. Выявлена закономерность: чем специфичнее условия среды, тем беднее биоразнообразие бактерий в составе некробиома и выше численность отдельных физиологических групп.
В результате изучения ферментативной активности выделенных групп микроорганизмов установлено, что наибольшая доля приходится на виды с фосфатазной активностью (до 59,4% в зависимости от срока разложения), протеолитиков (до 52,8% в зависимости от срока разложения) и виды с декарбоксилазной активностью (до 27,2% в зависимости от срока разложения). Доля сульфатредукторов в исследуемых микробных сообществах оказалась самой незначительной (до 13,3% в зависимости от срока разложения).
Примечательно, что доля биохимически активных групп микроорганизмов исследуемых биотопов в процессе разложения трупов стабильно увеличивалась независимо от срока разложения и колебаний температуры окружающей среды. За период исследования доля протеолитически активных микроорганизмов увеличилась в 1,5 раза, доля гликолитически активных – в 1,7 раза; обладающих фосфатазной активностью – в 2,8 раза, нитрогеназной – в 1,6 раза, декарбоксилазной – в 2,3 раза, сульфатредуцирующей – в 1,8 раза.
Судебно-медицинское значение полученных экспериментальных данных по закономерностям изменения состава эколого-трофических профилей некробиома заключается в том, что из всех изученных параметров ферментативная активность микроорганизмов является наиболее чувствительным критерием, позволяющим разработать альтернативные подходы к объективной оценке срока давности наступления смерти [8].
Установлено, что в путрификации ведущую роль играют микроорганизмы, ответственные за гнилостный распад белков или аммонификацию [9]. Установлена относительная стабильность их ведущей микрофлоры в составе изученных образцов трупа и его ложа. Аммонификаторов в составе некробиома домашней свиньи обнаружено десять протеолитически активных штаммов, у курицы и домовой мыши – по восемь. При исследовании активности протеолитических ферментов у бактерий определено, что наибольшая способность вызывать разложения азотсодержащих органических соединений трупного материала характерна представителям родов Bacillus, Clostridium и Pseudomonas. Среди них установлены доминирующие, а также и малочисленные и редкие виды бактерий. Подтверждено, что в процессе гниения органики трупного материала происходит снижение общего числа видов, численность отдельных таксонов резко увеличивается, и получают возможность свободно размножаться наиболее конкурентоспособные.
При изучении особенностей физиологических групп микроорганизмов, участников диагенеза костных фрагментов, выделены 8 из 14 физиологических групп микроорганизмов - участников диагенеза: аммонификаторы, нитрифицирующие бактерии, бактерии, разлагающие клетчатку, возбудители молочнокислого и уксуснокислого брожения, азотфиксаторы и денитрифицирующие бактерии.
Большинство выделенных физиологических групп находятся в постоянной динамике, что, вероятно, связано с неравномерным распределением в почве органических веществ, образующихся в разное время в процессе микробной трансформации костных фрагментов. Исключение составила группа споровых аммонификаторов, которая на протяжении 7 месяцев модельного эксперимента, независимо от давности наступления смерти и температуры окружающей среды, развивалась стабильно, и её доля от общей численности микроорганизмов всегда была значительной (от 20,5 до 39,1%).
Анализ качественных и количественных характеристик данных групп микроорганизмов дает возможность не только оценить интенсивность происходящих процессов во времени, но и в зависимости от таких факторов среды, как кислотность почвы и температура окружающей среды. Полученные данные могут быть использованы в качестве инструмента исследования для оценки времени наступления смерти (посмертного интервала), расследования причин смерти, а также определения местонахождения захороненных трупов.
После смерти трупы являются доступным источником азотсодержащей органики, они не только колонизируются микроорганизмами, которые представляют нормальную микрофлору человека, но также и видами, которые обычно не способны колонизировать живые ткани или колонизируют их при определенных условиях [10; 11]. К таким видам относятся Bac. mycoides, Bac. subtilis, Cl. putrificum и Cl. sporogenes, которые в основном обитают в почве, контролируя процессы биогеохимической трансформации азота. С помощью серии выполненных исследований по изучению коллагеназной активности бациллярно-клостридиального комплекса микроорганизмов доказано, что ферменты бактерий, обнаруженных в составе некробиома, являются чувствительными молекулярными маркерами интенсивности разложения костных фрагментов. Установлено, что виды рода Bacillus и Clostridium способны гидролизовать коллаген в широких физиологических диапазонах рН и температуры.
Несмотря на зависимость метаболизма бацилл и клостридий от кислотности среды и температурного диапазона, изучение протеолитически активных видов, участвующих в разрушении костного коллагена, является перспективным для целей судебно-медицинской экспертизы, особенно в случае объективного установления позднего постмортального периода. Хотя использование ферментов бактерий в судебно-экспертной практике еще остается сложной задачей, применение их субстратной специфичности может существенно расширить доказательную базу проводимых экспертиз.
Выводы
- В результате проведенной работы установлено, что микробиом трупа (некробиом) – это гетерогенная, специфичная в разных местообитаниях система, установлены квантитативные показатели его представителей, изучено влияние ряда абиотических факторов на процессы разложения мертвого вещества, описана бактериальная сукцессия в процессе деструкции трупа.
- Для объективной оценки давности наступления смерти большое значение имеет такой фактор, как совокупность и разнообразие микроорганизмов, участвующих в сложных процессах разложения органического вещества.
- Возрастающая проблема разработки новых методов определения давности наступления смерти, особенно в позднем посмертном периоде, заставляет задумываться об использовании в практике судебно-медицинской экспертизы биоиндикаторных тест-систем для установления давности наступления смерти, где индикаторами будут служить ферменты, являющиеся продуктом жизнедеятельности микроорганизмов в разные сроки посмертного периода.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья подготовлена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации в рамках выполнения государственного задания.
Реализовано в рамках Программы развития опорного университета ФГБОУ ВО «Петрозаводский государственный университет» на период 2017-2021 годов.
Библиографическая ссылка
Лаврукова О.С., Сидорова Н.А., Приходько А.Н., Толмачев И.А. СПЕЦИФИКА МИКРОБНОГО РАЗЛОЖЕНИЯ МЕРТВЫХ ТЕЛ // Современные проблемы науки и образования. – 2020. – № 3. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=29728 (дата обращения: 19.04.2024).