Сетевое издание
Современные проблемы науки и образования
ISSN 2070-7428
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,940

АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ МУТАЦИИ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИЕЙ, В ПОВОЛЖСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

Исхакова А.Г. 1 Тороповский А.Н. 2 Золотарев А.В. 1 Павлова О.Н. 2 Комарова М.В. 3 Викторов Д.А. 2
1 ГБУЗ «Самарская областная клиническая офтальмологическая больница имени Т.И. Ерошевского»
2 ООО «ТестГен»
3 ФГАОУ ВО «Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королева»
В статье представлены современные подходы к диагностике пролиферативной и непролиферативной диабетической ретинопатии. На основе патогенеза выделены изменения в генах, которые могут лежать в основе наследственной предрасположенности к данному заболеванию. В настоящее время принято считать, что патогенез диабета является многофакторным, но генетические факторы риска играют в нем фундаментальную роль. Недавние исследования в области генома выявили несколько генетических локусов, участвующих в патогенезе диабета 1-го типа и 2-го типа. Установлено, что механизмы патогенеза диабетической ретинопатии разнообразны и достаточно сложны, однако немаловажную роль в них играют генетические факторы, которые, вероятно, определяют восприимчивость пациента к этой болезни, а также различия в частоте возникновения диабетической ретинопатии между индивидуумами с диабетом 1-го и 2-го типа. В ходе нашего исследования установлено, что полиморфные локусы генов VEGF rs2010963, AKR1B1 rs759853, ITGA2 rs2910964, ADRB3 rs4994, APOE rs7412, APOE 429358, рассматриваемые независимо друг от друга, не связаны с развитием диабетической ретинопатии в изученной группе больных сахарным диабетом 2-го типа. На наш взгляд, отрицательный результат данного исследования обусловлен гетерогенностью изученной группы по возрасту и стажу сахарного диабета, а также его различной компенсацией. Эти известные факторы риска диабетической ретинопатии могли помешать выявлению более слабых наследственных предрасположенностей.
диабетическая ретинопатия
полиморфизм
генетические факторы риска
nos3
akr1b1
vegf
itga2
icam1
adrb3
apoe
1. Воробьева И.В., Меркушенкова Д.А. Диабетическая ретинопатия у больных сахарным диабетом второго типа. Эпидемиология, современный взгляд на патогенез. Обзор. // Офтальмология. 2012. Т. 9, № 4. С. 18–21.
2. Шадричев Ф.Е., Астахов Ю.С., Григорьева Н.Н., Шкляров Е.Б., Александрова О.Н., Крянева О.Я., Рутенбург Е.Л., Карпова И.А. Эпидемиологические аспекты поражения сетчатки у больных сахарным диабетом (результаты скрининга диабетической ретинопатии в Санкт-Петербурге) // Офтальмологические ведомости. 2009. №4 (2). С. 13–18.
3. Noda K., Ishida S. Role of chronic inflammation in diabetic retinopathy. Inflammation and Regeneration. 2013. Vol. 33. N 5. P. 230-237.
4. Щулькин А.В., Колесников А.В., Баренина О.И., Никифоров А.А. Генетические маркеры развития диабетической ретинопатии // Фундаментальные исследования. 2014. №4-2. С. 411-414.
5. Балашевич Л.И., Измайлов А.С. Диабетическая офтальмопатия. СПб.: Человек, 2012. 336 с.
6. Abhary S., Hewitt A.W., Burdon K.P., Craig J.E. A systematic meta-analysis of genetic association studies for diabetic retinopathy. Diabetes. 2009. № 58(9). P. 2137- 2147.
7. Могилевский С.Ю., Бушуева О.В., Зяблицев С.В. Связь полиморфизмов RS759853 и RS9640883 гена AKR1B1 с клинико-лабораторными показателями при диабетической ретинопатии // Офтальмология. Восточная Европа. 2017. Т. 7, № 1. С. 8-17.
8. Муженя Д.В., Тугуз А.Р., Дорошенко А.С., Руденко К.А., Анохина Е. Н. Роль LEU28/28PRO полиморфизмов гена АРОЕ в регуляции липидного обмена у высококвалифицированных спортсменов республики Адыгея // Вестник Адыгейского государственного университета. 2013. №1(116). С. 73-80.
9. Муслимова Э.Ф., Реброва Т.Ю., Афанасьев С.А., Сергиенко Т.Н., Репин А.Н. Ассоциация генов ITGB3 и NOS3 с тяжестью течения ишемической болезни сердца при наличии и отсутствии сахарного диабета 2-го типа // Сахарный диабет. 2016. Т. 19. №4. С. 303-308.
10. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука, 1991. 271 с.
11. Namipashaki A., Razaghi-Moghadam Z., Ansari-Pour N. The Essentiality of Reporting Hardy-Weinberg Equilibrium Calculations in Population-Based Genetic Association Studies. Cell J. 2015. V. 17(2). Р. 187–192. DOI: 10.22074/cellj.2016.3711.
12. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.: Практика, 1998. 459 с.

Одной из актуальнейших проблем современного человечества является неуклонно растущий уровень заболеваемости сахарным диабетом (СД). По сути, это совокупность заболеваний эндокринного характера, связанных с нарушением процесса усвоения глюкозы и обменных процессов в организме. Начальные стадии диабета могут протекать малосимптоматично, и заболевание обнаруживается на поздних стадиях развития, сопровождается системными осложнениями. Одним из таких сопутствующих осложнений является диабетическая ретинопатия (ДР) – заболевание, связанное с поражением сосудов сетчатки глаза и приводящее к инвалидности по зрению в 80–90% случаев; по данным Всемирной организации здравоохранения ДР является основной причиной слепоты у трудоспособного населения развитых стран и входит наряду с возрастной макулярной дегенерацией и глаукомой в число ведущих причин снижения зрения в возрастной группе старше 65 лет. Подсчитано, что слепота у больных СД развивается в 25 раз чаще, чем в среднем в популяции. Несмотря на то что данные о распространенности ДР варьируют в значительных пределах, бесспорным является тот факт, что, чем больше стаж СД, тем выше шансы развития ДР. В среднем патологические изменения сетчатки выявляются примерно у 80% пациентов, страдающих СД в течение 10 и более лет [1–3].

Длительность диабета и недостаточный гликемический контроль являются двумя наиболее важными факторами в развитии ретинопатии. Однако эти факторы сами по себе не объясняют возникновение сосудистых осложнений. Кроме того, у ряда пациентов с плохим гликемическим контролем даже за длительный период заболевания диабетом ретинопатия не развивается, в то время как у некоторых пациентов с хорошим гликемическим контролем ретинопатия развивается уже в течение нескольких лет. Соответственно, можно предположить наличие влияния генетических факторов на развитие ДР [4, 5]. В этом аспекте изучение генетических маркеров ДР имеет особую значимость в плане прогнозирования патологии и выделения групп риска на доклиническом этапе, когда профилактические меры имеют высокую эффективность действия.

В 2009 г. австралийскими исследователями Abhary S. с соавт. был проведен мета-анализ результатов нескольких исследований, касающихся взаимосвязи между генетическими факторами риска и развитием ДР [6]. Авторами исследования было проанализировано 702 публикации, из которых 160 публикаций – о геномном полиморфизме при ДР. Было выделено порядка 196 полиморфизмов 20 генов. Согласно разрозненным данным анализируемых публикаций выявлено, что полиморфизмы по генам NOS3, AKR1B1, VEGF, ITGA2 и ICAM1, ADRB3, APOE ассоциированы с ДР, при этом ген AKR1B1 имеет наибольшее число полиморфизмов, связанных с ДР. Большинство исследований приводят достаточное количество доказательств влияния генетического фактора на развитие ДР, однако участие каждого из отмеченных генов-кандидатов на ДР неоднозначно. Исследователи склоняются к тому, что существует зависимость между генами-ассоциантами и этнической принадлежностью контрольной группы [7–9].

Выявление генетического риска развития ДР у больных СД 2-го типа еще до начала проявления клинической картины может способствовать повышению эффективности ранней диагностики, усовершенствованию стратегии профилактики и терапии данного осложнения.

С учетом всего вышесказанного целью исследования являлся анализ сопряженности полиморфных участков генов-кандидатов с наличием ДР у пациентов в Поволжской популяции больных СД и ДР.

Материал и методы исследования

Клинические исследования проводились на базе ГБУЗ «Самарская областная клиническая офтальмологическая больница имени Т.И. Ерошевского». Выделение ДНК и анализ полиморфных маркеров генов осуществлялись на базе ООО «ТестГен» и ООО «Джинэкст» (г. Ульяновск).

Всего в исследование были включены 475 пациентов: 79 мужчин и 396 женщин (17% и 83% соответственно), обратившихся в период с 2015 по 2018 гг. в ГБУЗ «Самарская областная клиническая офтальмологическая больница имени Т.И. Ерошевского», удовлетворяющих критериям включения/исключения и давших письменное информационное согласие на участие в научном исследовании. Возраст обследованных составил от 24 до 89 лет, в среднем 64,4±9,6 года. Этнический состав обследованных: 84% русские, 3,5% татары, 2% башкиры, 3,6% мордва, 2,1% чуваши, 4,8% представители других народов Поволжья.

Критерии включения:

– больные с СД 2-го типа;

– длительность заболевания – 10 лет и более от момента постановки диагноза;

– возраст старше 18 лет;

– наличие подписанного пациентом информированного согласия на участие в научном исследовании;

– наличие заключения по результатам офтальмологического осмотра;

– наличие результатов анализов на гликированный гемоглобин и глюкозу.

Критерии исключения:

– СД 1-го типа;

– хронические соматические заболевания в стадии декомпенсации;

– заболевания органа зрения, затрудняющие диагностику ДР.

У 272 пациентов на момент осмотра ретинопатии не было, у 100 – отмечена непролиферативная ретинопатия, у 23 – препролиферативная, у 80 – пролиферативная ДР.

Объектом исследования явились пробы венозной крови, полученные от пациентов, больных СД 2-го типа, прошедших офтальмологический осмотр. Образцы предоставлены ГБУЗ «Самарская областная клиническая офтальмологическая больница имени Т.И. Ерошевского».

Всем пациентам были проведены биохимические исследования крови (общий холестерин, триглицериды, глюкоза, гликированный гемоглобин), офтальмологическое обследование (измерение остроты зрения, внутриглазного давления, заключение о наличии/отсутствии катаракты, макулярного отека, оценка состояния стекловидного тела, офтальмоскопирование для выявления ДР), а также выявляли тип, стаж, вид терапии и степень компенсации СД на основании заключения эндокринолога.

Для выделения ДНК использовали набор реагентов «ДНК-Кровь-М» производства ООО «ТестГен», оптимально работающий при роботизированном выделении на станции Tecan.

В работе были использованы олигонуклеотидные праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени, подобранные коллективом автором исходя из данных NCBI GeneBank. При проведении ПЦР реакционную смесь составили: dNTP, праймеры (VICE, FAME) и зонды с флуоресентными метками по FAM/HEX (BHQ). На основании предварительно проведенных исследований было установлено, что оптимальным для постановки ПЦР является использование в реакционной смеси 2х Encyclo GC буфер и Encyclo polymerase. Для амплификации в работе использовали детектирующий амплификатор DTprime (ООО «ДНК-Технология», г. Москва). Процесс амплификации состоял из первичной денатурации, циклов амплификации и кривой плавления. Протокол амплификации был оптимизирован экспериментально. Детекция продуктов амплификации проводилась в реальном времени.

В разрабатываемую мультилокусную панель было отобрано 7 точечных мутаций, определение которых будет выявлять повышенный риск формирования ДР при СД: VEGF rs2010963, AKR1B1 rs759853, ITGA2 rs2910964, ADRB3 rs4994, ICAM1 rs13306430, APOE rs7412, APOE 429358. Оба локуса гена APOE при статистической обработке полученных данных анализировали совместно.

Статистический анализ данных выполняли в среде пакета IBM SPSS 21. Описательная статистика дана в виде абсолютных значений и частот (%) генотипов по изучаемым аллелям. Тестировались гипотезы доминирования одного или другого варианта мутантного локуса. Рассчитывали также частоты отдельных аллелей в изучаемых группах и проверяли их соответствие закону Харди–Вайнберга [10, 11]. Для сопоставления частот генотипов или отдельных аллелей с наличием ретинопатии использовали критерий хи-квадрат Пирсона (c2). Для количественного представления силы слияния возможного генотипа на риск ДР рассчитывались отношения шансов и их 95%-ные доверительные интервалы. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05 [12].

Результаты исследования и их обсуждение

Для анализа взаимосвязей генотипов пациентов с наличием или отсутствием ДР нами проведены исследования для проверки гипотезы доминирования того или иного аллеля и расчет уровня значимости каждого аллеля по критериям хи-квадрат и отношения шансов.

Характеристика распределения генотипов полиморфного участка гена VEGF rs2010963

В таблице 1 приведен анализ сопряженности между полиморфными участками гена-кандидата VEGF rs2010963 и наличием ДР.

Таблица 1

Взаимосвязь между полиморфными участками гена VEGF rs2010963

и наличием ДР

Генотип VEGF rs2010963 

Нет ДР
n=272

Есть ДР n=203

Отношение шансов (95%-ный доверительный интервал)

c2

p

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1 C/C

89

32,72%

63

31,0%

1

0,15

0,926

Гетерозигота G/C

108

39,71%

83

40,9%

1,09 (0,71–1,67)

Гомозигота 2 G/G

75

27,57%

57

28,1%

1,07 (0,67–1,72)

Гипотеза рецессивности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1

89

32,7%

63

31,0%

1

0,15

0,697

Гетерозигота + гомозигота 2

183

67,3%

140

69,0%

1,08 (0,73–1,6)

Гипотеза доминантности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 + гетерозигота

197

72,4%

146

71,9%

1

0,02

0,903

Гомозигота 2

75

27,6%

57

28,1%

1,03 (0,68–1,54)

 

По данным, представленным в таблице, можно рассчитать теоретические доли доминантных и рецессивных аллелей участка данного гена, вычислить их доли и сопоставить с распределением аллелей среди фактических пациентов.

Таким образом:

наблюдаемые аллели С: 89+89 +108 +63+63+83=495;

наблюдаемые аллели G: 108+75+75 +83+57+57=455.

Всего: С+ G = 495+455=950.

Доля С = 495/950=0,521.

Доля G = 455/950=0,479.

Теоретические частоты генотипов определяются из соотношения:

(a+b)2=a2+2ab=b2, где в роли a и b подставим обозначения нуклеотидных полиморфизмов.

Следовательно, теоретические доли генотипов следующие:

СС = 0,5212=0,271=27,2%;

GC = 2*0,521*0,479=0,499= 49,9%;

GG = 0,4792=0,229=22,9%.

Теоретически именно с рассчитанной частотой должны были бы встречаться изучаемые генотипы в популяции, однако с фактическими данными теоретические расчеты не совпали (табл. 2).

Таблица 2

Анализ распределения частоты генотипов гена VEGF rs2010963 в популяции

 

Наблюдаемые

Теоретические

Общая группа

Абс

%

Абс

%

Гомозигота 1

152

32,0%

129

27,2%

Гетерозигота

191

40,2%

237

49,9%

Гомозигота 2

132

27,8%

109

22,9%

c2=17,9, р<0,001

При исследовании гена VEGF rs2010963 установлено, что распределение генотипов в изучаемом участке не соответствует равновесию Харди–Вайнберга ни у пациентов с наличием, ни с отсутствием ДР, ни среди всех обследованных.

Так, наблюдаемые частоты генотипов в общей группе были: CC – 152 человека (32,0%), GC – 191 человек (40,2%) и GG – 132 человека (27,8%). Это соответствует частотам аллелей C – 52,1% и G – 47,9% и, соответственно, теоретическому распределению генотипов CC/GC/GG – 27,2% / 49,9% / 22,9%, что статистически значимо отличается от наблюдаемых частот (c2=17,9, р<0,001). Меньшая почти на 10%, чем теоретически ожидаемая, частота гетерозигот по гену VEGF в изучаемой группе больных, на наш взгляд, может быть связана с неслучайным отбором генотипов при формировании изучаемых групп больных СД из общей популяции.

Характеристика распределения генотипов полиморфного участка гена ADRB3 rs4994

В таблице 3 приведен анализ сопряженности между полиморфными участками гена-кандидата ADRB3 rs4994 и наличием ДР.

Таблица 3

Взаимосвязь между полиморфными участками гена ADRB3 rs4994 и наличием ДР

Генотип ADRB3 rs4994

Нет ретинопатии

Есть ретинопатия

Отношение шансов (95%-ный доверительный интервал)

c2

p

 

Абс.

%

Абс.

%

Референс – 1-й аллель

 

 

Гомозигота 1 T/T

218

80,15%

162

79,8%

1

1,564

0,458

Гетерозигота T/C

52

19,12%

41

20,2%

1,06 (0,67–1,68)

Гомозигота 2 C/C

2

0,74%

0

0,0%

Итого

272

100%

203

100%

 

 

 

Гипотеза рецессивности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 T/T

218

80,1%

162

79,8%

1

0,009

0,926

Гетерозигота +гомозигота 2 (T/C + C/C)

54

19,9%

41

20,2%

1,02 (0,65–1,61)

Гипотеза доминантности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 + гетерозигота (T/T+ T/C

270

99,3%

203

100,0%

1

1,499

0,221

Гомозигота 2 (C/C)

2

0,7%

0

0,0%

 

По данным, представленным в таблице, также рассчитывали теоретические доли доминантных и рецессивных аллелей участка данного гена, вычисляли их доли и сопоставляли с распределением аллелей среди фактических пациентов.

Таким образом:

наблюдаемые аллели Т: 218+218 +52 +162+162+41=853;

наблюдаемые аллели С: 52+2+2 +41+0+0=97.

Всего: Т+ С = 853+97=950.

Доля Т = 853/950=0,898.

Доля С = 97/950=0,102.

Теоретические частоты генотипов определяются из соотношения:

(a+b)2=a2+2ab=b2, где в роли a и b подставим обозначения нуклеотидных полиморфизмов.

Следовательно, теоретические доли генотипов следующие:

ТТ = 0,8982=0,806=80,6%;

ТC = 2*0,898*0,102=0,183= 18,3%;

СС = 0,1022=0,010=1,1%.

Так как теоретически рассчитанная частота изучаемых генотипов в популяции должна совпадать с реальной, мы провели сопоставление теоретических и практических данных (табл. 4).

Таблица 4

Анализ распределения частоты генотипов гена ADRB3 rs4994 в популяции

 

 

Наблюдаемые

Теоретические

Общая группа

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1

380

80,0%

383

80,6%

Гетерозигота

93

19,6%

87

18,3%

Гомозигота 2

2

0,4%

5

1,1%

 

При исследовании гена ADRB3 rs4994 установлено, что распределение генотипов в изучаемом участке соответствует равновесию Харди–Вайнберга у пациентов обеих групп и в популяции в целом.

Так, наблюдаемые частоты генотипов в общей группе были: ТТ – 380 человек (80,0%), ТC – 93 человека (19,6%) и СС – 2 человека (0,4%). Это соответствует частотам аллелей Т – 89,8% и С – 10,2% и, соответственно, теоретическому распределению генотипов ТТ/ТC/СС – 80,6% / 18,3% / 1,1%, что статистически незначимо отличается от наблюдаемых частот.

Необходимо отметить, что редкий аллель гена ADRB3 в позиции rs4994 у изученной группы больных встречался лишь у 10% пациентов, что соответствует теоретической частоте гомозигот в популяции порядка 1%. Это статистически неотличимо от наблюдаемых больных из обеих групп с носителями генотипа CC. Если данный генотип и имел неблагоприятное прогностическое влияние на риск развития ретинопатии, то при данном объеме исследования его невозможно было доказать.

Характеристика распределения генотипов полиморфного участка гена ITGA2 rs2910964

В таблице 5 приведен анализ сопряженности между полиморфными участками гена-кандидата ITGA2 rs2910964 и наличием ДР.

Таблица 5

Взаимосвязь между полиморфными участками гена ITGA2 rs2910964 и наличием ДР

Генотип ITGA2 rs2910964

Нет ретинопатии

Есть ретинопатия

Отношение шансов (95%-ный доверительный интервал)

c2

p

 

Абс.

%

Абс.

%

Референс – 1-й аллель

 

 

Гомозигота 1 C/C

94

34,56%

72

35,5%

1

0,142

0,932

Гетерозигота C/T

134

49,26%

97

47,8%

0,95 (0,63–1,41)

Гомозигота 2 T/T

44

16,18%

34

16,7%

1,03 (0,6–1,78)

Итого

272

100%

203

100%

 

 

 

Гипотеза рецессивности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 C/C

94

34,7%

72

35,5%

1

0,031

0,860

Гетерозигота +гомозигота 2 (C/T+ T/T)

177

65,3%

131

64,5%

0,97 (0,66–1,41)

Гипотеза доминантности   дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 + гетерозигота (C/C + C/T)

228

84,1%

169

83,3%

1

0,066

0,797

Гомозигота 2 T/T

43

15,9%

34

16,7%

1,07 (0,65–1,74)

 

По данным, представленным в таблице, также рассчитывали теоретические доли доминантных и рецессивных аллелей участка данного гена, вычисляли их доли и сопоставляли с распределением аллелей среди фактических пациентов.

Таким образом:

наблюдаемые аллели С: 94+94 +134 +72+72+97=563;

наблюдаемые аллели Т: 134+44+44 +97+34+34=387.

Всего: С+Т = 563+387=950.

Доля С = 563/950=0,592.

Доля Т = 387/950=0,408.

Теоретические частоты генотипов определяются из соотношения:

(a+b)2=a2+2ab=b2, где в роли a и b подставим обозначения нуклеотидных полиморфизмов.

Следовательно, теоретические доли генотипов следующие:

СС= 0,5922=0,350=35,0%;

CТ = 2*0,592*0,408=0,483= 48,3%;

ТТ = 0,4082=0,167=16,7%.

Так как теоретически рассчитанная частота изучаемых генотипов в популяции должна совпадать с реальной, мы провели сопоставление теоретических и практических данных (табл. 6).

Таблица 6

Анализ распределения частоты генотипов гена ITGA2 rs2910964 в популяции

 

Наблюдаемые

Теоретические

Общая группа

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1

166

34,9%

166

35,0%

Гетерозигота

231

48,6%

229

48,3%

Гомозигота 2

78

16,4%

80

16,7%

 

При исследовании гена ITGA2 rs2910964 установлено, что распределение генотипов в изучаемом участке соответствует равновесию Харди–Вайнберга у пациентов обеих групп и в популяции в целом.

Так, наблюдаемые частоты генотипов в общей группе были: СС – 166 человек (34,9%), СТ – 231 человек (48,6%) и ТТ – 78 человек (16,4%). Это соответствует частотам аллелей С – 59,2% и Т – 40,8% и, соответственно, теоретическому распределению генотипов СС/СТ/ТТ – 35,0% / 48,3% / 16,7%, что статистически незначимо отличается от наблюдаемых частот.

Следует отметить, что взаимосвязи генотипов по данному гену не выявлено во всех вариантах рассмотрения при р>>0,005.

Характеристика распределения генотипов полиморфного участка гена AKR1B1 rs759853

В таблице 7 приведен анализ сопряженности между полиморфными участками гена-кандидата AKR1B1 rs759853 и наличием ДР.

Таблица 7

Взаимосвязь между полиморфными участками гена AKR1B1 rs759853 и наличием ДР

Генотип AKR1B1 rs759853

 

Нет ДР, n=272

Есть ДР n=203

Отношение шансов (95%-ный доверительный интервал)

c2

p

Абс.

%

Абс.

%

 

Гомозигота 1 G/G

104

38,24%

73

36,0%

1

1,482

0,477

Гетерозигота G/A

132

48,53%

95

46,8%

1,03 (0,69–1,53)

Гомозигота 2 A/A

36

13,24%

35

17,2%

1,39 (0,8–2,41)

Гипотеза рецессивности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1

104

38,2%

73

36,0%

1

0,257

0,612

Гетерозигота +гомозигота 2

168

61,8%

130

64,0%

1,1 (0,76–1,61)

Гипотеза доминантности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 + Гетерозигота

236

86,8%

168

82,8%

1

1,467

0,226

Гомозигота 2

36

13,2%

35

17,2%

1,37 (0,82–2,26)

 

По данным, представленным в таблице, также рассчитывали теоретические доли доминантных и рецессивных аллелей участка данного гена, вычисляли их доли и сопоставляли с распределением аллелей среди фактических пациентов.

Таким образом:

наблюдаемые аллели G: 104+104 +132 +73+73+95=581;

наблюдаемые аллели A: 132+36+36 +95+35+35=369.

Всего: G+A = 581+369=950.

Доля G = 581/950=0,612.

Доля A = 369/950=0,388.

Теоретические частоты генотипов определяются из соотношения:

(a+b)2=a2+2ab=b2, где в роли a и b подставим обозначения нуклеотидных полиморфизмов.

Следовательно, теоретические доли генотипов следующие:

GG= 0,6122=0,375=37,5%;                           

GA = 2*0,612*0,388=0,475= 47,5%;

AA = 0,3882=0,150=15,0%.

Так как теоретически рассчитанная частота изучаемых генотипов в популяции должна совпадать с реальной, мы провели сопоставление теоретических и практических данных (табл. 8).

Таблица 8

Анализ распределения частоты генотипов гена AKR1B1 rs759853 в популяции

 

Наблюдаемые

Теоретические

Общая группа

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1

177

37,3%

178

37,5%

Гетерозигота

227

47,8%

226

47,5%

Гомозигота 2

71

14,9%

71

15,0%

 

При исследовании гена AKR1B1 rs759853 установлено, что распределение генотипов в изучаемом участке соответствует равновесию Харди–Вайнберга у пациентов обеих групп и в популяции в целом.

Так, наблюдаемые частоты генотипов в общей группе были: GG – 177 человек (37.3%), GA – 227 человек (47,8%) и AA – 71 человек (14,9%). Это соответствует частотам аллелей G – 61,2% и A – 38,8% и, соответственно, теоретическому распределению генотипов GG/GA/AA – 37,5% / 47,55% / 15,0%, что статистически незначимо отличается от наблюдаемых частот.

Характеристика распределения генотипов полиморфных участков гена APOE rs7412 и rs429358

Исследование гена APOE мы проводили в двух участках – rs7412 и rs429358. В таблице 9 приведен анализ сопряженности между полиморфным участком rs7412 гена-кандидата APOE и наличием ДР.

Таблица 9

Взаимосвязь между полиморфными участками гена APOE rs7412 и наличием ДР

Генотип APOE rs741

 

Нет ДР, n=272

Есть ДР n=203

Отношение шансов (95%-ный доверительный интервал)

c2

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1 C/C

229

84,19%

169

83,3%

1

0,134

0,935

Гетерозигота C/T

41

15,07%

32

15,8%

1,06 (0,64–1,75)

Гомозигота 2 T/T

2

0,74%

2

1,0%

1,36 (0,19–9,72)

Гипотеза рецессивности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1

229

84,2%

169

83,3%

1

0,076

0,783

Гетерозигота +гомозигота 2

43

15,8%

34

16,7%

1,07 (0,66–1,75)

Гипотеза доминантности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 + гетерозигота

270

99,3%

201

99,0%

1

0,087

0,768

Гомозигота 2

2

0,7%

2

1,0%

1,34 (0,19–9,62)

 

Также по табличным данным рассчитывали теоретические доли доминантных и рецессивных аллелей участка rs7412 гена APOE, вычисляли их доли и сопоставляли с распределением аллелей среди фактических пациентов.

Таким образом:

наблюдаемые аллели С: 229+229 +41 +169+169+32=869;

наблюдаемые аллели Т: 41+2+2 +32+2+2=81.

Всего: С+Т = 869+81=950.

Доля С = 869/950=0,915.

Доля Т = 81/950=0,085.

Теоретические частоты генотипов определяются из соотношения:

(a+b)2=a2+2ab=b2, где в роли a и b подставим обозначения нуклеотидных полиморфизмов.

Следовательно, теоретические доли генотипов следующие:

СС= 0,9152=0,837=83,7%;

СТ = 2*0,915*0,085=0,156= 15,6%;

ТТ = 0,0852=0,007=0,7%.

Так как теоретически рассчитанная частота изучаемых генотипов в популяции должна совпадать с реальной, мы провели сопоставление теоретических и практических данных (табл. 10).

Таблица 10

Анализ распределения частоты генотипов гена APOE rs7412 в популяции

 

Наблюдаемые

Теоретические

Общая группа

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1

398

83,8%

398

83,7%

Гетерозигота

73

15,4%

74

15,6%

Гомозигота 2

4

0,8%

3

0,7%

 

При исследовании участка rs7412 гена APOE установлено, что распределение генотипов в изучаемом участке соответствует равновесию Харди–Вайнберга у пациентов обеих групп и в популяции в целом.

Так, наблюдаемые частоты генотипов в общей группе были: СС – 398 человек (83,8%), СТ – 73 человек (15,4%) и ТТ – 4 человека (0,8%). Это соответствует частотам аллелей С – 91,5% и Т – 8,5% и, соответственно, теоретическому распределению генотипов СС/СТ/ТТ – 83,7% / 15,6% / 0,7%, что статистически незначимо отличается от наблюдаемых частот.

По аналогичной схеме проведен анализ участка rs429358 гена APOE (табл. 11).

Таблица 11

Взаимосвязь между полиморфными участками гена APOE rs429358 и наличием ДР

Генотип APOE rs429358

 

Нет ДР, n=272

Есть ДР n=203

Отношение шансов (95%-ный доверительный интервал)

c2

p

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1 T/T

204

75,00%

160

78,8%

1

0,95

0,622

Гетерозигота T/C

65

23,90%

41

20,2%

0,8 (0,52–1,25)

Гомозигота 2 C/C

3

1,10%

2

1,0%

0,85 (0,14–5,15)

Гипотеза рецессивности дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1

204

75,0%

160

78,8%

1

0,946

0,331

Гетерозигота +гомозигота 2

68

25,0%

43

21,2%

0,81 (0,52–1,24)

Гипотеза доминантности   дикого (1-го) аллеля

 

 

 

 

 

 

 

Гомозигота 1 + Гетерозигота

269

98,9%

201

99,0%

1

0,015

0,901

Гомозигота 2

3

1,1%

2

1,0%

0,89 (0,15-5,39)

 

Также по табличным данным рассчитывали теоретические доли доминантных и рецессивных аллелей участка rs429358 гена APOE, вычисляли их доли и сопоставляли с распределением аллелей среди фактических пациентов.

Таким образом:

наблюдаемые аллели Т: 204+204 +65 +160+160+41=834;

наблюдаемые аллели С: 65+3+3 +41+2+2=116.

Всего: Т+С = 834+116=950.

Доля С = 834/950=0,878.

Доля Т = 116/950=0,122.

Теоретические частоты генотипов определяются из соотношения:

(a+b)2=a2+2ab=b2, где в роли a и b подставим обозначения нуклеотидных полиморфизмов.

Следовательно, теоретические доли генотипов следующие:

ТТ= 0,8782=0,771=77,1%;

ТС = 2*0,878*0,122=0,214= 21,4%;

СС = 0,1222=0,015=1,5%.

Так как теоретически рассчитанная частота изучаемых генотипов в популяции должна совпадать с реальной, мы провели сопоставление теоретических и практических данных (табл. 12).

Таблица 12

Анализ распределения частоты генотипов гена APOE rs429358 в популяции

 

Наблюдаемые

Теоретические

Общая группа

Абс.

%

Абс.

%

Гомозигота 1

364

76,6%

366

77,1%

Гетерозигота

106

22,3%

102

21,4%

Гомозигота 2

5

1,1%

7

1,5%

 

При исследовании участка rs429358 гена APOE установлено, что распределение генотипов в изучаемом участке соответствует равновесию Харди–Вайнберга у пациентов обеих групп и в популяции в целом.

Так, наблюдаемые частоты генотипов в общей группе были: ТТ – 364 человека (76,6%), ТС – 106 человек (22,3%) и СС – 5 человек (11%). Это соответствует частотам аллелей Т – 87,8% и С – 12,2% и, соответственно, теоретическому распределению генотипов ТТ/ТС/СС – 77,1% / 21,4% /1,5%, что статистически незначимо отличается от наблюдаемых частот.

В настоящее время принято считать, что патогенез диабета является многофакторным, но генетические факторы риска играют в нем фундаментальную роль. Недавние исследования в области генома выявили несколько генетических локусов, участвующих в патогенезе диабета как 1-го, так и 2-го типа. Установлено, что механизмы патогенеза ДР разнообразны и достаточно сложны, однако немаловажную роль в них играют генетические факторы, которые, вероятно, определяют восприимчивость пациента к этой болезни, а также различия в частоте ДР между индивидуумами с диабетом 1-го типа и 2-го типа.

Длительность заболевания диабетом и недостаточный гликемический контроль являются двумя наиболее важными факторами в развитии ретинопатии [6]. Однако эти факторы сами по себе не объясняют возникновение сосудистых осложнений. Кроме того, у ряда пациентов с плохим гликемическим контролем даже за большой промежуток времени ретинопатия не развивается, в то время как у некоторых пациентов с хорошим гликемическим контролем ретинопатия развивается уже в течение нескольких лет. В этой связи предполагается важная роль генетических факторов в развитии ДР [5].

Выводы. В ходе нашего исследования установлено, что полиморфные локусы генов VEGF rs2010963, AKR1B1 rs759853, ITGA2 rs2910964, ADRB3 rs4994, APOE rs7412, APOE 429358, рассматриваемые независимо друг от друга, не связаны с развитием ДР в изученной группе больных сахарным диабетом 2-го типа. На наш взгляд, отрицательный результат данного исследования обусловлен гетерогенностью изученной группы по возрасту и стажу сахарного диабета, а также его различной компенсацией. Эти известные факторы риска ДР могли помешать выявлению более слабых наследственных предрасположенностей.


Библиографическая ссылка

Исхакова А.Г., Тороповский А.Н., Золотарев А.В., Павлова О.Н., Комарова М.В., Викторов Д.А. АНАЛИЗ ЧАСТОТЫ МУТАЦИИ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИЕЙ, В ПОВОЛЖСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2019. – № 6. ;
URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=29283 (дата обращения: 18.05.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074