Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Стручко Г.Ю. 1 Драндрова Е.Г. 1 Меркулова Л.М. 1 Стоменская И.С. 1 Кострова О.Ю. 1

---

1 ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

В работе исследовано морфофункциональное состояние вилочковой железы потомства животных с врожденным иммунодефицитом при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина. С помощью общегистологических и люминесцентно-гистохимических методов исследован тимус крыс-самок в норме, после введения канцерогена и на фоне иммунодефицита. Установлено, что при развитии аденокарциномы толстой кишки в вилочковой железе наблюдаются значимые морфофункциональные изменения, характерные для акцидентальной инволюции. Этот процесс особенно выражен в группе животных, которые родились от самок с иммунодефицитом. Проявление инволюции - изменение морфологии дольки, достоверное уменьшением ее морфометрических показателей (диаметр коркового и площадь мозгового вещества), выраженный дисбаланс уровня серотонина, гистамина и катехоламинов во всех ее структурах с достоверным повышением индекса (серотонин+гистамин)/катехоламины. Кроме того, в 1,5 раза увеличивается количество тучных клеток с умеренной и выраженной степенью дегрануляции. Таким образом, можно заключить, что предшествующий иммунодефицит у самок до беременности сказывается на морфофункциональных изменениях железы у потомства. В связи с этим развивающаяся индуцированная злокачественная опухоль быстрее ускользает от иммунного надзора и становится более агрессивной с развитием ранних метастазов.

Статья в формате PDF

188 KB

тимус

канцерогенез

врожденный иммунодефицит

инволюция

апоптоз

тучные клетки

биогенные амины.

1. Бережная Н.М. Физиологическая система соединительной ткани и онкогенез. Роль клеточных компонентов стромы в развитии опухоли / Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун // Онкология. - 2016. - Т. 18, № 1. - С. 4-14.

2. Finn O.J. Immuno-oncology: understanding the function and dysfunction of the immune system in cancer // Annals of oncology. – 2012. – Vol. 23, № 8. – P. 116-119.

3. Higashijima J. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice / J. Higashijima, M. Shimada, M. Chikakiyo et al. // Anticancer Res. - 2009. - Vol. 29, № 1. - P. 385-393.

4. Sonoda K. Decreased growth rate of lung metastatic lesions after splenectomy in mice / K. Sonoda, K. Izumi, Y. Matsui, M. Inomata, N. Shiraishi, S. Kitano // Eur. Surg. Res. - 2006. - Vol. 38, № 5. - P. 469-475.

5. Яглова Н.В. Влияние активации иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности на постнатальный морфогенез органов иммунной системы потомства / Н.В. Яглова, С.С. Обернихин // Проблемы репродукции. – 2013. - № 1. - С. 73-77.

6. Стручко Г.Ю. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса при химическом канцерогенезе, вызванном введением 1,2-диметилгидразина / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев // Морфология. - 2014. - Т. 146. - № 5. - С. 35-39.

7. Стручко Г.Ю. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика опухолей желудочно-кишечного тракта на фоне иммунной недостаточности / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев и др. // Вестник Чувашского университета. – 2011. - № 3. - С. 450-456.

8. Стручко Г.Ю. Морфофункциональные изменения селезенки и тимуса крысят, родившихся от спленэктомированных крыс-самок / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, О.Ю. Кострова и др. // Успехи современного естествознания. - 2014. - № 9-2. - С. 70-72.

9. Драндрова Е.Г. Иммуногистохимические исследования клеточного состава тимуса при канцерогенезе в условиях вторичного иммунодефицита / Е.Г. Драндрова, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова и др. // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 3. URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=19825 (дата обращения: 10.02.2018).

10. Elenkov I.J. Stress System Organization, Physiology and Immunoregulation / I.J. Elenkov, G.P. Chrousos // Neuroimmunomodulation. -2006. - Vol. 13. - P. 257-267.

11. Симбирцев А.С. Цитокины в лабораторной диагностике / А.С. Симбирцев, А.А. Тотолян // Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство / под ред. В.В. Долгова, В.В. Меньшикова. – М.: ГОЭТАР-Медиа, 2012. – Т. 2. – С. 193-229.

12. Hellstrand K. Histamine in cancer immunotherapy: a preclinical background // Semin. оncol. - 2002. - V. 29, N 3. - P. 35-40.

13. Москвичев Е.В. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика вилочковой железы при экспериментальном канцерогенезе в условиях вторичной иммунной недостаточности: автореф. дис. … докт. мед. наук. – Оренбург, 2013. - 30 с.

Сейчас не вызывает сомнений, что развитие как фундаментальной, так и практической онкологии обусловлено успехами в молекулярной генетике и иммунологии. В результате этого мы приблизились к пониманию сущности и особенностей формирования противоопухолевой защиты от стадии распознавания опухолевых антигенов до этапа реализации уничтожения опухоли. Кроме того, произошло изменение ряда взглядов на взаимоотношение опухоли и клеток системы иммунитета [1]. Таким образом, можно заключить, что современная онкоиммунология переживает переосмысление некоторых утверждений и понятий, принятых ранее, а именно, что онкологические заболевания – не патология иммунной системы, в отличие от аллергических и аутоиммунных заболеваний, при которых нарушения иммунитета являются основной причиной развития болезни. Установлено также, что при развитии опухоли изменения со стороны иммунитета зачастую вызваны влиянием уже возникшей опухоли, т.е. вторичны [1].

Интерес и актуальность исследования механизмов работы системы иммунитета обусловлены современными запросами практической медицины и связаны с возможностью профилактики развития различных заболеваний. Изученность механизмов работы системы иммунитета до сих пор недостаточна. Это связано, прежде всего, с кооперацией большого количества клеток в иммунных реакциях, а также с недостатком доступных методов их выявления [2].

Установлено, что колоректальный рак является одной из наиболее распространенных опухолей с различным метастазированием в легкие, печень и другие органы [3]. Агрессивный рост и достаточно быстрое метастазирование колоректального рака очень часто связывают с нарушением противоопухолевой активности из-за предшествующего удаления селезенки [3; 4].

Кроме того, выявлено, что снижение противоопухолевого иммунитета у потомства грызунов связано с дисбалансом иммунной системы крысы в первые месяцы беременности [5]. Доказано, что в патогенезе развития опухоли в организме животных имеет принципиальное значение серьезный дисбаланс эндокринной системы: выраженная атрофия тимуса с деструкцией эпителиальных клеток, структур окружения коркового и мозгового вещества, а также торможение тимопоэза [6]. Однако в литературе встречается много информации о том, что сама иммунная недостаточность организма способствует развитию более агрессивной опухоли с формированием ранних метастазов [7].

Именно поэтому изучение морфофункциональных особенностей как иммунных, так и эндокринных органов на различных уровнях у потомства животных с вторичным иммунодефицитом, а также разработка эффективных способов коррекции иммунодефицита в организме матери для получения здорового потомства является весьма актуальным и приоритетным.

Цель исследования – исследование морфофункционального состояния вилочковой железы потомства животных с врожденным иммунодефицитом при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина.

Материал и методы

Эксперименты проведены на нелинейных белых крысах (n=100). Уход за животными, которые содержались в виварии, осуществлялся в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Исследования проводились на 4 группах животных: 1) интактный контроль (потомство здоровых самок, n=25), 2) контрольная группа (потомство спленэктомированных крыс, n=25), 3) первая подопытная группа (потомство здоровых самок, которым через 1 месяц после рождения начинали вводить канцероген (1,2-диметилгидразин) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 недель, n=25), 4) вторая подопытная группа (потомство спленэктомированных самок, которым через 1 месяц после рождения начинали вводить 1,2-диметилгидразин из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 недель, n=25).

При изучении потомства подопытных групп отмечено, что развитие иммунодефицита у самок не влияет на формирование пола крысят. Во всех исследуемых группах рождалось 55-60% самок и 40-45% самцов. Развитие опухоли толстой кишки на фоне введения канцерогена у крысят обоих полов происходило в одинаковом проценте случаев. Умерщвление животных проводили путем декапитации через 6 месяцев после окончания курса введения 1,2-диметилгидразина.

Во время вскрытия животных всех групп проводилась ревизия органов грудной и брюшной полости с обязательным исследованием толстой кишки. Патоморфологическое исследование включало в себя изучение частоты развития злокачественных новообразований, их локализацию и морфотипирование. Животные, у которых опухоль не формировалась, в исследование не включались.

При морфофункциональном исследовании вилочковой железы нами использовались следующие методы.

1. Окраска гематоксилином и эозином. Орган фиксировался в 10%-ном нейтральном формалине в течение суток, промывался в проточной воде, и затем выполнялась стандартная проводка на тканевом гистопроцессоре Leica ASP 200 (Leica, Германия). Парафиновые срезы тимуса наносили толщиной 3 мкм на стекла Mentzel Glasses super frost (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.
2. Люминесцентно-гистохимический метод Хилларпа-Фалька использовался для выявления норадреналина и серотонина в структурах тимуса. Криостатные препараты изучались под люминесцентным микроскопом ЛЮМАМ-4 в течение двух суток.
3. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса-Эвена-Роста проводился для обнаружения структур вилочковой железы, содержащих гистамин. Криостатные срезы органа изучались в течение суток с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-4.
4. Для определения уровня норадреналина, серотонина и гистамина в структурах тимуса применялся метод цитоспектрофлуориметрии. Количественные показатели измерялись с помощью насадки ФМЭЛ-1А, которая устанавливалась на микроскоп ЛЮМАМ-4. Уровень выше перечисленных медиаторов в люминесцирующих клетках тимуса определяли в условных единицах (единицы флюоресценции по шкале вольтметра). Для оценки функционального состояния структур тимуса высчитывался индекс (серотонин+гистамин)/катехоламины. Увеличение этого соотношения указывает на подавление физиологической активности клеток, снижение этого индекса свидетельствует об их стимуляции [5].  
5. Окраска по Унна с использованием полихромного толуидинового синего применялась для изучения качественного и количественного состава тучных клеток вилочковой железы. При микроскопии тучных клеток учитывалась их степень дегрануляции. Выделяли недегранулированные, слабо, умеренно и сильно дегранулированные мастоциты.
6. Компьютерная морфометрия. С помощью системы архивирования на микроскопе Leica DM4000B (Leica, Германия) получали оцифрованные фотографии препаратов с использованием фотокамеры Leica DFC 425 и лицензионной программы Leica Application Sute 3.6.0 (Leica, Германия). Морфометрия площади мозгового вещества и толщины коркового вещества долек вилочковой железы выполнялась с использованием этой же программы.

Статистическую значимость полученных данных определяли по t-критерию Стьюдента. Данные представляли в виде средней арифметической величины (M) и ее средней ошибки (m).

Результаты исследования и их обсуждение

Наши эксперименты показали, что введение канцерогена приводит к формированию предраковых изменений, таких как пролиферация крипт толстой кишки и клеточная дисплазия разной степени. На фоне этого через 6 месяцев формируется аденокарцинома умеренной и низкой дифференцировки.

При морфологическом исследовании было отмечено, что тимус крыс на фоне развития злокачественной опухоли достоверно отличается от такового в контрольной группе. Установлено, что у интактных животных дольки тимуса чаще имеют овальную форму и разделены междольковыми перегородками, в пределах которых иногда определяется небольшое количество жировой ткани. Корковое вещество представлено в основном лимфоцитами, внутри которых хорошо различимо ядро диаметром от 2,7 до 3,6 мкм и ядрышко в центре. Встречаются также более крупные тимоциты с диаметром ядра от 3,8 до 4,9 мкм и базофильной цитоплазмой по периферии. Иногда выявляются крупные лимфоциты неправильной формы с большим ядром (до 5,4 мкм) и узким ободком оксифильной цитоплазмы. В корковом веществе обнаруживаются кровеносные сосуды, которые направлены от мозгового вещества на периферию дольки лучеобразно в междольковых септах. Мозговое вещество также в основном представлено лимфоцитами с крупным ядром диаметром от 3,5 до 4,8 мкм и с узкой базофильной цитоплазмой на периферии.

У потомства самок с предшествующей спленэктомией, которым вводили канцероген, отмечали уменьшение тимуса в массе и размерах, стирание границы между корковым и мозговым веществом, замещение паренхимы железы жировой тканью.

На периферии вилочкой железы часто выявляются участки скопления эпителиальных клеток с малым количеством лимфоцитов, которые окружены жировой прослойкой. В центре тимуса визуализируются небольшого размера дольки, в мозговом веществе которых определяются скопления эпителиоцитов. При морфометрии регистрируется снижение площади мозгового вещества почти в 2 раза и толщины коркового вещества на 22,3%. Масса тимуса уменьшается не столь значительно - на 20%, что можно связать с замещением рабочей паренхимы органа жировой тканью.

Люминесцентно-гистохимическое исследование вилочковой железы подтверждает общегистологическую картину: отмечается стирание границ между тимусными дольками, междольковые септы расширены и содержат жировую ткань. Обработка препаратов ортофталиевым альдегидом по методу Кросса на гистамин позволила зарегистрировать преобладание интенсивности люминесценции мозгового вещества над корковым. Количество люминесцирующих гранулярных клеток и их размеры по сравнению с группой интактного контроля уменьшено.

Использование цитоспектрофлуориметрии позволило установить, что уровень серотонина в люминесцирующих гранулярных клетках (ЛГК) коркового вещества и в тучных клетках достоверно снижается, интенсивность люминесценции катехоламинов в лимфоцитах коркового и мозгового вещества также уменьшается, а содержание гистамина в клетках кортико-медуллярной зоны, тучных клетках и лимфоцитах мозгового вещества, напротив, достоверно выше, чем в группе интактного контроля (таблица).

Уровень серотонина (СТ), гистамина (ГСТ) и катехоламинов (КА) (в усл. ед.) в клетках тимуса крыс интактного контроля, контрольной и опытных групп

* - Р<0,01; ** - Р<0,001 по сравнению с крысами интактного контроля.

Вычисляемый нами индекс (серотонин+гистамин)/катехоламины в клетках кортико-медуллярной зоны, тимоцитах коркового и мозгового вещества возрастал на 21, 35 и 104% соответственно. В клетках субкапсулярной зоны и тучных клетках это соотношение, наоборот, снижалось на 10 и 33% соответственно.

На срезах, окрашенных толуидиновым синим по Унна, визуализируются расширенные междольковые соединительнотканные перегородки с тучными клетками разной степени дегрануляции. Во второй опытной группе выявляется в среднем 7-10 тучных клеток, что в более чем в 1,5 раза выше, чем у интактных крыс. Мастоциты с умеренной и выраженной степенью дегрануляции составляют больше половины всех тучных клеток.

Итак, нами выявлено, что при развитии аденокарциномы толстой кишки в вилочковой железе наблюдаются значимые морфофункциональные изменения, характерные для разных стадий акцидентальной инволюции. Этот процесс особенно выражен в группе животных, которые родились от самок с иммунодефицитом. Проявление инволюции - изменение морфологии дольки, достоверное уменьшением ее морфометрических показателей, выраженный дисбаланс уровня серотонина, гистамина и катехоламинов во всех ее структурах с достоверным повышением индекса (серотонин+гистамин)/катехоламины. Кроме того, в наших предыдущих исследованиях с использованием поликлональных антител зарегистрировано снижение клеточной пролиферации тимоцитов как коркового, так и мозгового вещества, уменьшение количества эпителиальных клеток в тимусных дольках, увеличение числа дендритных клеток, макрофагов и клеток АПУД-серии [8]. Помимо этого, в тимусе выявляется увеличение числа клеток, экспрессирующих белок апоптоза P-53 и снижение bcl-2⁺-клеток [9].

Как известно, серотонин, катехоламины и гистамин оказывают выраженное влияние на многие физиологические процессы в органах и тканях. Катехоламины, например, активируют Т-хелперы, стимулируют антителообразование, усиливают функциональную активность тучных клеток, а также влияют на активность клеток моноцитарно-макрофагальной системы [10]. Кроме того, они являются индукторами как гуморального, так и клеточного иммунитета, влияя на продукцию противовоспалительных цитокинов в крови [11]. Серотонин, наряду с норадреналином, усиливает взаимодействие клеток иммунной системы и их миграцию, активирует фагоцитоз и продукцию интерлейкинов [11]. Гистамин же, напротив, тормозит фагоцитоз и дегрануляцию тучных клеток, угнетает работу клеток гуморального иммунитета [12]. Участвуя в клеточном иммунитете, гистамин усиливает цитотоксичность Т-клеток и натуральных киллеров [12; 13].

Согласуя с литературными данными, зарегистрированное нами увеличение индекса (серотонин+гистамин)/катехоламины практически во всех структурах тимуса, и особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, будет свидетельствовать об угнетении функциональной активности и последующем развитии акцидентальной инволюции железы.

В настоящее время нет сомнений, что развивающаяся злокачественная опухоль и тимус оказывают друг на друга взаимное влияние. Так как большинство опухолей являются тимусзависимыми, то их развитие практически всегда сопровождается инволютивными изменениями в железе. Это обнаруживается и при злокачественном росте, в том числе с использованием химических канцерогенов [7]. Доказано, что при канцерогенезе индуцируется выброс из вилочковой железы незрелых Т-лимфоцитов, которые направляются в очаг злокачественного роста и поддерживают рост перерожденных клеток [9]. Поступление тимусных лимфоцитов в опухоль способствует усилению активности роста как самих опухолевых клеток, так и сосудов путем продукции фактора роста эндотелия [6].

Таким образом, изучив гистологическую картину, содержание биогенных аминов и иммуногистохимический фенотип тимуса, можно заключить, что предшествующий иммунодефицит у самок до беременности сказывается на морфофункциональных изменениях железы у потомства. В связи с этим развивающаяся индуцированная злокачественная опухоль быстрее ускользает от иммунного надзора и становится более агрессивной с развитием ранних метастазов.

Библиографическая ссылка