Сетевое издание

Современные проблемы науки и образования

ISSN 2070-7428

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,006

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Ларионов А.В. 1 Волобаев В.П. 1 Сердюкова Е.С. 1

---

1 ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет»

Проведено изучение показателей фрагментации ДНК методом ДНК-комет в щелочной модификации в условиях разного уровня воздействия радиационного фактора в бытовых условиях. Проведен учет объемной активности (ОА) радона, мощности амбиентной эквивалентной дозы (МАЭД) гамма-излучения и плотности потока бета-излучения. Среднее значение ОА радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Средний уровень фрагментации ДНК составил 3,48%. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям (доля ДНК в хвосте кометы, длина хвоста кометы, момент хвоста кометы) был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости. Показатели ДНК-комет не отличались значимо в зависимости от изменения уровня радона. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения. При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.

Статья в формате PDF

208 KB

ионизирующее излучение

радон

днк-кометы

щелочная модификация днк-комет

эффекты низких доз облучения

1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. The cellular and molecular carcinogenic effects of radon exposure: a review // Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 7, pp. 14024-14063.

2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. et al. Assessing the level of chromosome aberrations in peripheral blood lymphocytes in long-term resident children under conditions of high exposure to radon and its decay products // Mutagenesis, 2015, vol. 30, pp. 677–683.

3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells // Exp. Cell Res., 1988, vol. 175, pp. 184–191.

4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. Towards a more reliable comet assay: optimising agarose concentration, unwinding time and electrophoresis conditions // Mutat. Res., 2011, vol. 724, no. 1–2, pp. 41-45.

5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. et al. A cross platform public domain PC image analysis program for the comet assay // Mutation Research, 2003, vol. 534, pp. 15-20.

6. Glantz S.A. Primer of Biostatistics / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, 7 edition, 2011. – 320 p.

7. Georgakilas A.G., O’Neill P., Stewart R.D. Induction and repair of clustered DNA lesions: what do we know so far? // Radiat. Res., 2013, vol. 180, pp. 100–109.

8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Assessment of radiation induced DNA damage in human peripheral blood lymphocytes using COMET assay // Int. J. Life Sci. Scientifi. Res., 2017, vol. 3, no. 4, pp. 1208-1214.

9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Usage of the standard and modified comet assay in assessment of DNA damage in human lymphocytes after exposure to ionizing radiation // Radiology and Oncology, 2009, vol. 43, no. 2, pp. 97-107.

10. Batar B., Guven M., Baris S. et al. DNA repair gene XPD and XRCC1 polymorphisms and the risk of childhood acute lymphoblastic leukemia // Leuk. Res., 2009, vol. 33. pp. 759–763.

11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Polymorphisms of DNA repair genes: ADPRT, XRCC1, and XPD and cancer risk in genetic epidemiology // Meth. Mol. Biol., 2009, vol. 471. pp. 305–333.

12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. et al. DNA excision repair and double-strand break repair gene polymorphisms and the level of chromosome aberration in children with long-term exposure to radon // Int. J. Radiat. Biol., 2016, vol. 92, no. 8, pp. 466-474.

13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. et al. Lack of adverse effect of smoking habit on DNA strand breakage and base damage, as revealed by the alkaline comet assay // Mutat. Res., 1999, vol. 440, pp. 19–25.

14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Seasonal variations as predictive factors of the comet assay parameters: a retrospective study // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.

Воздействие радона хорошо изучено в диапазоне высоких концентраций. Установленные гигиенические нормативы предусматривают уровень эквивалентной равновесной объемной активности (ЭРОА) в 200 Бк/м3 как границу допустимой объемной активности радона в воздухе жилых помещений. В то же время в ряде стран допустимый уровень увеличен до 400 Бк/м3, что объясняется, прежде всего, геологическими особенностями территории. С другой стороны, существует точка зрения о необходимости снижения допустимого уровня до 2 пКю/л, что соответствует 74 Бк/м3. В рамках современной парадигмы ВОЗ и принципа линейного беспорогового увеличения радиационных эффектов даже небольшое радиационное воздействие приводит к увеличению риска возникновения стохастических эффектов (прежде всего онкозаболеваний).

Очевидно, что небольшие радиационные эффекты, воздействующие на большие группы людей, могут приводить к социально значимому увеличению частоты онкологической заболеваемости [1]. Вследствие этого представляется крайне актуальным накопление информации об эффектах действия различных типов ионизирующего излучения в малых дозах, которому подвержено в той или иной степени все население планеты. Увеличение ЭРОА радона выше 200 Бк/м3 признается нежелательным для большинства принятых нормативов в области радиационной гигиены. В то же время лишь 5-10% жилых помещений можно отнести к помещениям с таким уровнем воздействия. Уровень объемной активности (ОА) радона в 2 пКю/л (74 Бк/м3) и выше может отмечаться в 20-50% жилых помещений в зависимости от типа застройки и географического расположения. Очевидно, что даже малоинтенсивное воздействие радона может приводить к значимому увеличению заболеваемости, учитывая глобальные масштабы проблемы. Представляется актуальным исследование влияния низкодозовых нагрузок плотноионизирующего излучения на организм человека.

Радон признается в настоящее время одним из наиболее опасных канцерогенов, действующих на человека. В природе радиационный радоновый фактор не играет существенной роли, поскольку газ радон рассеивается в большом объеме воздуха и достаточно быстро распадается (период полураспад Rn222=3,82 суток). В то же время жилые и технические постройки представляют собой своеобразные ловушки, накапливающие радон (до 10 крат в сравнении с открытым воздухом). Очаги выделения радона часто располагаются спорадически, радон рассматривается в качестве ведущей причины повышения частоты хромосомных аберраций в схожих экспонированных группах [2].

Одним из эффективных методов биомониторинга является прямая оценка степени повреждения ДНК в клетках крови методом «ДНК-комет» (гель-электрофорез отдельных клеток). Данный метод предусматривает лизис клеток, помещенных в агарозный гель, при этом ДНК мигрирует в электрическом поле. Клетки с увеличенной частотой двойных разрывов характеризуются увеличением миграции ДНК к аноду. В 1988 году в работе Singh и коллег была предложена щелочная модификация метода, включающая этап лизиса при рН>13 [3]. Данная версия значительно повышает чувствительность метода, позволяя выявлять одиночные разрывы, щелочелабильные сайты, сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, а также сайты незавершенной репарации [4]. Поскольку для большинства генотоксикантов преобладают эффекты одиночных разрывов ДНК, щелочная модификация метода позволила существенно увеличить информативность и чувствительность теста. Одно из главных преимуществ – возможность выявить генотоксическое воздействие в условиях одновременного действия цитотоксических факторов, которые приводят к формированию хромосомных нарушений, но не обладают генотоксическим действием. В условиях рН>12 ДНК денатурирует, и нити расплетаются вследствие разрушения водородных связей между 2 спиралями. При достижении рН 12,6 щелочелабильные сайты, например апуриновые/апиримидиновые сайты, трансформируются в одиночные разрывы ДНК. При рН>13 достигается максимальная степень трансформации щелочелабильных сайтов.

Материалы и методы

Характеристика выборки

Каждый обследованный заполнял персональную анкету, включавшую информацию о возрасте, состоянии здоровья, употреблении табака и алкоголя, производственных вредностях, рентгенодиагностических процедурах, авиаперелетах, прививках и приемах лекарственных препаратов в течение 3 месяцев, предшествующих обследованию. Была отобрана группа из 39 обследованных, не подвергавшихся потенциально генотоксическим факторам. Все обследованные были не старше 40 лет. Всего было обследовано 18 мужчин (средний возраст 29 лет) и 21 женщина (средний возраст 31 год).

Исследование проводили в соответствии с требованиями Комиссии по этике Кемеровского государственного университета, протокол исследования утвержден на заседании Комиссии № 4 от 10.10.2016 г. Каждый участник подписывал форму информированного согласия, содержащую информацию о целях исследования.

Образцы биоматериала

Образцы венозной крови собирались в вакуумные пробирки емкостью 4 мл, содержащие натрий-ЭДТА в качестве антикоагулянта. Сбор материала происходил в период с ноября 2016 г. по апрель 2017 г. В течение 1-2 часов образцы переправлялись лабораторию. Все образцы кодировались и обрабатывались. Выполнение метода «ДНК-комет» начиналось немедленно после поступления образцов.

Гель-электрофорез отдельных клеток (метод «ДНК-комет»)

Метод «ДНК-комет» выполнялся в щелочной модификации, разработанной Singh с коллегами [3]. Первый слой геля представлял собой 1% раствор стандартной агарозы (Applichem, США). Для нанесения клеток использовали 1% агарозу с низкой температурой плавления (low melting point agarose, Applichem, США) при 39 °С. 70 мкл взвеси клеток крови в легкоплавкой агарозе вносили на стекло со стандартной агарозой и помещали на лед до полного застывания геля. После застывания стекла помещали в лизирующий буфер при температуре 4 °С на 12 часов. Состав лизирующего буфера: 2,5 моль/л NaCl («Вектон», Россия), 0,1 моль/л Nа2ЭДТА («Вектон», Россия), 1% Тriton Х-100 (Amresco, США), 10% ДМSO («Вектон», Россия). После лизиса проводился горизонтальный электрофорез (300 мА, 25 В, 30 мин.) в щелочном буфере (pH>13). Электрофорезу предшествовала 20-мин. обработка щелочным буфером (300 мМ NaOH («Вектон», Россия), 1 мМ Nа2ЭДТА («Вектон», Россия). Лизис и электрофорез проводился при 4 °С при отсутствии прямых солнечных лучей. После электрофореза стекла троекратно нейтрализовали в фосфатно-солевом буфере PBS рН 7,5 (Amresco, США). После этого стекла обрабатывались 70% этанолом в течение 5 минут. Препараты высушивались и окрашивались 50 мкл однократного SYBR GREEN («Биотех-Индустрия», Россия).

Анализ «комет»

Оценка параметров фрагментации проводилась путем микрофотографирования препаратов, окрашенных SYBR GREEN, с помощью микроскопа Zeiss Axio Imager 2. Всего фотографировалось 100 случайно отобранных комет от каждого исследованного образца при увеличении х400. Последующая обработка фотографий проведена с помощью комплекта ПО CASP [5]. Рассчитывались параметры длины хвоста кометы, момента хвоста, а также доля ДНК в хвосте кометы.

Статистические методы

Статистический анализ данных проводили с использованием пакета Statistica 10.0. Для количественных показателей рассчитывались средние значения и пределы 95% доверительного интервала (CI 95). Сравнение групп выполняли с использованием U-теста Манна-Уитни. Степень значимости была принята на уровне 5%. Корреляцию между показателями для случая непараметрических данных рассчитывали с использованием коэффициента корреляции Пирсона для рангов. При этом для выборок более 50 человек также рассчитывали значение критерия Стьюдента, основанное на значении коэффициента корреляции Пирсона [6].

Результаты

Доля ДНК в хвосте кометы не превышала 15%. Среднее значение объемной активности (ОА) радона в воздухе помещений составило 89,4 Бк/м3, значение МАЭД гамма-фона составило 0,12 мкЗв/ч, плотность потока бета-излучения 0,6 с-1. Уровень фрагментации ДНК по 3 показателям был повышен у мужчин, но данная тенденция не достигала статистической значимости (табл. 1).

Таблица 1

Показатели фрагментации ДНК у обследованных мужчин и женщин

В качестве граничного уровня ОА радона в воздухе был выбран уровень 74 Бк/м3, соответствующий 2 пКю/л воздуха. Средняя ОА радона составила 47 Бк/м3 в первой группе и 143 Бк/м3 во второй группе. Наибольшая информативность была установлена для показателя момента хвоста комет. Момент хвоста был повышен в группе с более высоким уровнем радона, но эта тенденция не достигла уровня статистической достоверности (табл. 2). Данная тенденция характерна только для обследованных мужчин.

Таблица 2

Показатели фрагментации ДНК в группах, дифференцированных по полу и ОА радона

Также была исследована возможная зависимость показателей ДНК от величины МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях. Для проверки был рассчитан коэффициент корреляции между показателями повреждений ДНК и МАЭД гамма-излучения. Была обнаружена положительная корреляция показателей ДНК-комет с увеличением мощности гамма-излучения (рисунок). При этом МАЭД гамма-излучения находилась в пределах допустимых норм во всех обследованных помещениях.

Зависимость показателей фрагментации ДНК от МАЭД гамма-излучения в жилых помещениях (r – коэффициент корреляции Спирмена, p – вероятность «нулевой» гипотезы)

Обсуждение

Радиационное воздействие

Ионизирующее излучение способно индуцировать образование кластеров повреждения ДНК, что реализуется в форме двухцепочечных разрывов и другими повреждениями, расположенными компактно. Редко- и плотноионизирующее излучение вызывает примерно одинаковое количество отдельных ДНК-поражений на единицу поглощенной дозы, но в случае с плотноионизирующим излучением (альфа-частицы) эти поражения распределены в меньшем количестве участков ДНК, что подразумевает увеличение числа повреждений в кластере; например, среднее число повреждений по кластеру, как правило, увеличивается с увеличением линейной передачи энергии [7]. Гамма-излучение, зафиксированное в местах проживания всех обследованных, не превышает регламентированных фоновых значений. Изменения гамма-фона, скорее всего, были вызваны особенностями строений и строительными материалами.

Анализ «комет»

Метод «ДНК-комет» представляет простой и быстрый тест, позволяющий эффективно измерять уровень повреждений ДНК и репарации повреждений, следующей после экспонирования. В данном исследовании не было обнаружено значительной гетерогенности в отношении уровня повреждения ДНК в исследованной популяции. В ряде работ, посвященных биологической дозиметрии, ранее отмечались трудности выявления эффекта малых доз облучения [8; 9]. В то же время в большинстве работ исследовались группы лиц, облученных внешним искусственным источником, например персонал радиологических и рентгенологических установок.

Измерения показателей фрагментации ДНК могут отражать как индивидуальный уровень повреждений ДНК, так и способность к репарации радиационных повреждений. Ранее в ряде работ установлена способность генов репарации модулировать частоту нарушений наследственного материала [10-12]. Наблюдаемая картина повреждений ДНК является результатом равновесия между нарушениями и репарацией ДНК, и низкий уровень повреждений или отсутствие выраженных корреляций может быть результатом как низкого числа повреждений, так и высокой индивидуальной эффективности репарации [13].

По некоторым оценкам, наибольший вклад в увеличение показателей ДНК комет для непроизводственных факторов вносят сезон года (параметры увеличены летом) и медицинское облучение [14]. В нашей работе эти факторы не могут оказывать значимого влияния, поскольку сбор биологического материала проводился в зимний период года, а все лица, проходившие рентгеновские обследования в течение 3 месяцев, предшествующих исследованию, были исключены из выборки. Отсутствие корреляций с объемной концентрацией радона, возможно, объясняется небольшим размером выборки. В дальнейшем планируется продолжение данной линии исследования с увеличением размера выборки.

Заключение

Исследование эффектов длительного воздействия малых доз облучения представляется сложной задачей, необходимость подбора выборок и контроля сопутствующих факторов способна исказить картину. В представленном исследовании не удалось выявить статистически значимых корреляций с показателями объемной активности радона, но в то же время обнаруженные корреляции с показателями гамма-фона указывают на перспективы данного исследования. Очевидна необходимость оценки фактора эффективности репарации обследованных для исследования такого типа, это позволило бы провести дифференцировку и сравнить людей с близкими характеристиками репарации.

Конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ (№ 16-34-60069\15 мол_а_дк).

Библиографическая ссылка