Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) является отдаленным последствием психической травмы [12]. Развитие ПТСР происходит через значительный промежуток времени после пребывания организма в экстремальных условиях. Для экспериментального моделирования ПТСР весьма удобна модель психоэмоционального стресса, вызванного сигналом о присутствии хищника [7]. Такая постановка стресса полностью исключает наличие у животных физических страданий. Поэтому данная ситуация имеет психотравмирующий характер и может характеризовать наличие ПТСР [13]. Однако далеко не все животные, подвергнутые психоэмоциональному стрессу, отличаются наличием ПТСР симптоматики. Для идентификации наличия или отсутствия ПТСР симптомов среди животных широко распространен анализ уровня тревожности в открытых рукавах крестообразного лабиринта. Соответственно, высокотревожные животные (ВТ) имеют ПТСР симптоматику, а у животных с низкой тревожностью (НТ) она отсутствует. В основе биологических эффектов эндогенных медиаторов тревожности трибулинов лежит ингибирование моноаминооксидаз (МАО). Моноаминооксидазы (МАО) – A и B участвуют в окислительном дезаминировании биогенных аминов. Кроме того, копродуктом МАО-реакции является перекись водорода (Н2О2), которая в присутствии металлов с переменной валентностью вовлекается в процессы свободнорадикального окисления [2, 8]. В ЦНС с активацией МАО связано развитие нейродегенеративных процессов. Однако до сих пор не изучена направленность изменений активности МАО после завершения психоэмоционального стресса у ВТ и НТ крыс. В данном исследовании мы изучали уровень активностей МАО-A и МАО-B и уровень основных звеньев свободнорадикального окисления: перикисного окисления липидов и карбонилирования белков в головном мозге ВТ и НТ крыс после завершения психоэмоционального стресса.
Материалы и методы
Работа выполнена на 32 белых беспородных лабораторных крысах. Психоэмоциональный стресс (n=16) моделировался запахом мочи кошки, ежедневно на протяжении 15 минут в течение 10 суток. Экспериментальная группа после 10-суточного воздействия стрессора содержалась в течение 3 суток в стандартных условиях. В контрольную группу вошли животные (n=16), которые не подвергались воздействию стрессора. Поведенческая активность животных определялась в тестах открытое поле и приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ). По времени пребывания в открытых рукавах ПКЛ животных разделяли на ВТ и НТ.
В гомогенатах головного мозга исследовали активности ферментов МАО-A и МАО-B, содержание карбонилированных белков, как показателя окислительной деструкция белков, а также молекулярных продуктов ПОЛ [1]. Для определения МАО-активности использовали 12.5 % (вес: объём) гомогенат головного мозга на 0,067М Na-фосфатном буфере (рН = 7,4) на сахарозе 0,25М. Далее его центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин, отбирали надосадочную жидкость и в течение 25 минут при 850 g центрифугировали. В полученной суспензии митохондрий определяли активности ферментов МАО-A и МАО-B. В качестве субстрата использовали серотонин и бензиламин гидрохлорид.
Для определения активности МАО-A в пробирку вносили 0,2 мл гомогената, который предварительно центрифугировали в течение 15 минут. Далее супернатант смешивали с 2,3 мл Na-фосфатным буфером (0,067М) и преинкубировали 30 минут при температуре 37 °С. Затем в опытные пробы добавляли 0,5 мл серотонина (3 мкМ раствора) и инкубировали в течение 30 минут при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 1 мл раствора семикарбазида на хлорной кислоте (25 мМ). Одновременно, в качестве контроля была поставлена проба, в которую не вносили субстрат в фазу инкубации, а добавляли его после остановки реакции. Для определения активности МАО-B использовалась та же методика, но в качестве субстрата использовался бензиламингидрохлорид.
Содержание продуктов перекисного окисления липидов оценивали спектрофотометрическим методом, предварительно экстрагируя липиды исследуемых тканей в смеси гептана и изопропанола [1]. Определение содержания конечных продуктов ПОЛ и интенсивность аскорбат-индуцированного ПОЛ осуществляли методом Львовской Е.И и соавт. [4]. Данные методики позволяют идентифицировать полярные липиды, растворимые в изопропиловом спирте, и неполярные липиды, растворимые в гептане; оценить содержание первичных продуктов ПОЛ (диеновые конъюгаты), вторичных продуктов ПОЛ (кетодиены и сопряженные триены) и конечных продуктов ПОЛ (основания Шиффа). Показатели окислительной модификации белков (ОМБ) в изучаемых образцах оценивали по образованию динитрофенилгидразонов [3].
Результаты обрабатывались общепринятыми методами дескриптивной статистики и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). Статистически значимые различия определяли с использованием критериев непараметрической статистики: Манна – Уитни (U).
Результаты и обсуждение
В общей выборке животных, уже спустя 3 суток после завершения повторных стрессорных воздействий, наблюдаются нарушения поведенческой активности в виде снижения более чем в 2 раза количества вертикальных стоек и уровня анксиогенной дефекации (таблица 1). Остальные показатели поведенческой активности не отличались статистически значимо от контроля. Кроме того, в этот период отмечено снижение активности МАО-A при наличии дисбаланса в содержании молекулярных продуктов ПОЛ. В частности, отмечено снижение гептан-растворимых диеновых конъюгатов и повышение содержания кетодиенов и сопряженных триенов.
Через 3 суток после завершения стрессорных воздействий у НТ животных наблюдалось снижение времени пребывания в открытых рукавах крестообразного лабиринта, при одновременном снижении вертикальной активности (таблица 2). При этом, у них не снизился уровень активности МАО-A. Уровень ПОЛ у них также находился в пределах контрольных значений. У ВТ животных, по сравнению с контролем в тесте открытого поля, снижена интенсивность реакции замирания. Одновременно у ВТ крыс, по сравнению с контролем, снижена активность МАО-A. При этом наблюдались положительные корреляции между уровнем активности МАО-A и поведенческими показателями, характеризующими сниженную тревожность.
Таблица 1
Влияние психоэмоционального стресса на показатели поведенческой активности, уровень активности МАО-A и МАО-B и показатели свободнорадикального окисления головного мозга
Показатели |
Контроль |
Стресс |
Время в открытых рукавах (сек) |
40,25±7,08 |
66,50±10,22 |
Вертикальная активность (количество стоек) |
9,5±0,4 |
4,1 ±0,1* |
Количество фекальных болюсов |
1,75±0,036 |
0,25±0,01* |
Время в закрытых рукавах |
484,25±52,84 |
437,38±84,45 |
Время в центре |
75,5±17,16 |
96,125 ±28,04 |
Активность МАО-A (нМ/мин/мг белка) |
1,44±0,07 |
0,94±0.012* |
Активность МАО-B(нМ/мин/мг белка) |
1,12±0,21 |
1,33±0,33 |
Диеновые конъюгаты Гептановая фаза (у.е.о) |
0,85±0,07 |
0,81±0,06* |
Кетодиены и сопряженные триены Гептановая фаза (у.е.о) |
0,097±0,015* |
0,12±0,019* |
Fe2+/аскорбат индуцированное ПОЛ (у.е.о) |
2,56±0,23 |
2,48±1,23 |
Карбонилированные белки (мМ/мкг белка) |
0,0043±0,002 |
0,0041±0,003 |
Карбонилированные белки индуцированное (мМ/мкг белка) |
0,0151±0,003 |
0,0184±0,002 |
Количество умываний |
1,25±1,26 |
2,25±1,28 |
Количество свисаний |
7,25± 0,93 |
8,62± 0,85 |
Примечания: Данные представлены в виде средней арифметической величины и ошибки средней (M±m), *статистически значимые различия по сравнению с контролем, у.е.о. – условные единицы окисления, выражаемые как отношение Е232/Е220 для диеновых конъюгатов и Е278/Е220 для кетодиенов и сопряженных триенов. |
В частности обнаружены корреляции между:
- МАО-A и временем проведения в светлом лабиринте (rs=0,833);
- МАО-A и свисанием (rs=0,718);
-МАО-A и процент времени в открытом поле (rs=0,833);
-МАО-A и время проведения в центре арены (rs=0,755).
Особенный интерес вызывает корреляционная зависимость между уровнем активности МАО-A и временем нахождения в открытых рукавах крестообразного лабиринта. Именно по этому показателю поведенческой активности проводилось разделение животных на восприимчивых и устойчивых к ПТСР. Соответственно просматривается закономерность – чем выше уровень активности МАО, тем больше времени животные проводят в открытых рукавах, то есть тем ниже будет общий уровень тревожности. Скорее всего нейрохимической основой подобной корреляционной связи является ключевая роль МАО в обмене биогенных аминов-нейротрансмиттеров. Соответственно на сниженном уровне МАО возможно повышение уровня серотонина, дофамина и норадреналина. В случае, если это будет сопровождаться угнетением ГАМК-ергической системы, вполне ожидаемо развитие тревожной симптоматики. В связи с этим стоит обратить внимание на положительную корреляцию между уровнем активности МАО-A и уровнем свисаний. Вполне возможно, что этот показатель характеризует склонность к реализации активных поведенческих стратегий в виде «реакции борьба-бегство». Интересно отметить, что ингибиторы МАО не нашли применения в психиатрии в качестве анксиолитиков, зато эффективно используются как антидепрессанты. По данным метаанализа ингибиторы МАО не проявили себя эффективными средствами в коррекции ПТСР, и представленные здесь результаты позволяют понять причину их неэффективности.
Кроме того, в головном мозге наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых вторичных продуктов ПОЛ (кетодиенов и сопряженных триенов), а также изопропанол-растворимых первичных продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов) после индукции в системе Fe2+/аскорбат. У НТ животных, по сравнению с контролем, повышено время пребывания в светлом лабиринте и время пребывания в центре, по сравнению с контролем. Кроме того, у НТ животных повышено содержание гептан-растворимых кетодиенов и сопряженных триенов. Таким образом, спустя 3 дня после завершения повторных стрессорных воздействий наблюдается снижение активности МАО-A в головном мозге при одновременном повышении содержания молекулярных продуктов ПОЛ. Это свидетельствует о том, что активация ПОЛ в головном мозге осуществляется по МАО-независимому механизму.
Вполне возможно, что усиление ПОЛ при психоэмоциональном стрессе имеет цитокин-зависимый характер. Известно, что усиление ПОЛ является одной из составляющих трансдукции цитокинового сигнала, а на фоне сниженного уровня глюкокортикоидов создаются благоприятные возможности для развития гиперцитокинемии.
Таблица 2
Постстрессорные показатели поведенческой активности, уровень активности МАО-A и МАО-B, показатели свободнорадикального окисления головного мозга у ВТ и НТ крыс
Показатели |
Контроль |
ВТ |
НТ |
Время в открытых рукавах (сек) |
40,25±7,08 |
33,75± 5,59 |
99,25±5,90*#
|
Вертикальная активность (количество стоек) |
9,25±0,4 |
5,25±0,27 |
3,25±0,5* |
Количество замираний |
14,00±1,25 |
6,5±0,89*# |
14,00±3,25 |
Активность МАО-A (нМ/мин/мг белка) |
1,44±0,07 |
0,72±0,02* |
1,17±0,11 |
Активность МАО-B (нМ/мин/мг белка) |
1,12±0,21 |
1,04±0,36 |
1,21±0,49 |
Кетодиены и сопряженные триены (гептановая фаза) |
0,097±0,015 |
0,14±0,01* |
0,11±0,01 |
Fe2+/аскорбат индуцированное ПОЛ |
2,48±0,23 |
2,64±0,08* |
2,50±0,3 |
Примечания: Данные представлены в виде средней арифметической величины и ошибки средней (M±m), *статистически значимые различия по сравнению с контролем, # статистически значимые различия между ВТ и НТ крысами. |
Причиной сниженного уровня активности МАО может быть типичный для этой модели ПТСР сниженный уровень глюкокортикоидов. Известно, что глюкокортикоиды обладают способностью, как повышать, так и понижать каталитическую активность МАО.
В настоящее время расшифрованы молекулярные механизмы, с помощью которых глюкокортикоиды регулируют экспрессию МАО. В частности, на промоторе гена МАО-A имеются несколько сайтов связывания с глюкокортикоид-респонсивным элементом′-GGTACAnnnTGTTCT-3′ и с транскрипционным фактором Sp1 [6 11]. Соответственно, связывание данного транскрипционного фактора приводит к подавлению экспрессии МАО-A. Открытый транскрипционный фактор R1(RAM2/CDCA7L), к примеру, связываясь с Sp1 сайтами, подавляет экспрессию гена МАО А [6]. Также, было установлено, что RAM2/CDCA7L ингибирует не только экспрессию гена МАО-A, но и угнетает экспрессию МАО-B. Регуляцию экспрессии МАО-B дополнительно осуществляет ещё один транскрипционный фактор – E2F ассоциированный фосфопротеин (EAPP). Выявлено, что супрессивный эффект глюкокортикоидов на экспрессию МАО-B обусловлен положительным влиянием EAPP [9]. Вместе с тем глюкокортикоиды характеризуются способностью угнетать каталитическую активность моноаминооксидаз [10]. Это явление, скорее всего, связано с глюкокортикоид-зависимым влиянием на микроокружение МАО. МАО является митохондриальным ферментом, а глюкокортикоиды способны угнетать функциональную активность митохондрий. Помимо этого, экспрессия МАО-A угнетается путём глюкокортикоид-зависимой стимуляции транслокации R1 из цитоплазмы в ядро [5]. Однако, в условиях выполненного исследования, активность МАО может быть снижена вследствие блокады глюкокортикоид-зависимых механизмов усиления экспрессии МАО.
Наблюдаемые поведенческие и нейрохимические особенности общей выборки проявлялись асимметрично у ВТ и НТ животных. В этот период у НТ животных повысилось, по сравнению с контролем, время пребывания в светлых рукавах, а у ВТ животных отсутствовали статистически значимые различия. Таким образом, характерные для общей выборки анксиолитические изменения поведенческой активности появляются исключительно благодаря НТ животным. Причем НТ животным вовсе не свойственно снижение активности МАО-A. Более того, уровень активности МАО-B был снижен только у ВТ животных. Полученный результат можно интерпретировать как проявление связи между снижением активности МАО и ростом тревожности. В связи с этим стоит обратить внимание на наличие в органах эндогенных ингибиторов активности МАО, называемых трибулинами, которые рассматриваются в качестве медиаторов тревожности. Вполне возможно, что у ВТ животных снижение активности МАО-A связано с приростом трибулиновой активности. На сегодняшний день можно постулировать наличие двух основных механизмов снижения активности МАО. Первый механизм связан со снижением экспрессии МАО. Исходя из того, что глюкокортикоиды играют ключевую роль в усилении экспрессии МАО-A, на фоне их сниженного содержания представляется вполне допустимым снижение экспрессии МАО за счет снижения уровня целого ряда глюкокортикоид-зависимых транскрипционных факторов, таких как KLF-11 или E2F [9]. Для реализации второго механизма не обязательно снижение экспрессии МАО. Тут вполне достаточно усиления трибулиновой активности. В наших исследованиях сниженный уровень МАО активности может быть реализован как по первому, так и по второму механизму. Выяснение роли каждого из них в снижении активности МАО-A может послужить предметом для дальнейших исследований.
Исследование выполнено при поддержке Российского Научного Фонда: Грант № 17-15-013418.
Библиографическая ссылка
Аллилуев А.В., Цейликман О.Б., Лапшин М.С., Комелькова М.В., Деев Р.В. ХАРАКТЕРИСТИКИ АКТИВНОСТЕЙ МОНОАМИНООКСИДАЗ И СОДЕРЖАНИЯ ПРОДУКТОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНОГО СТРЕССА // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26985 (дата обращения: 16.02.2025).