При ограничении кровоснабжения головного мозга происходит ряд патохимических процессов, приводящих к формированию инфаркта мозга в связи с гибелью клеток путем некроза и апоптоза. Максимально раннее терапевтическое воздействие на зону пенумбры (обратимо поврежденная ишемизированная ткань головного мозга вокруг сформированного очага инфаркта) позволяет сократить площадь потенциально необратимых повреждений в головном мозге и нарушений функций организма. Как правило, в области пенумбры сохранен энергетический метаболизм и присутствуют лишь функциональные изменения, но клетки остаются жизнеспособными с сохранным ионным гомеостазом. Для этого необходимо максимально раннее восстановление адекватной перфузии, а также проведение нейропротекторной терапии, уменьшающей разрушение нейронов вследствие ишемии и деполяризации мембран. Однако эффективность нейропротекторной терапии ишемических повреждений центральной нервной системы (ЦНС) является невысокой, что вызывает необходимость поиска новых методов, подходов для лечения ишемических поражений нервной ткани. В этом отношении внимание привлекает ЭПО – эгликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа, основная часть которого синтезируется пери- и тубулярными клетками почек в ответ на снижение парциального давления кислорода при участии гипоксия-индуцируемого фактора-1. Кроме этого, ЭПО может синтезироваться нейронами, клетками микроглии, гепатоцитами и др. клетками [1]. Основной точкой приложения для действия ЭПО являются клетки эритроидного ряда в костном мозге, где его эффект проявляется в пикомолярных концентрациях. Открытие рецепторов для ЭПО на нейронах позволило обнаружить его новые биологические эффекты [2]. В частности, ЭПО контролирует эмбриональное развитие мозга, способствует восстановлению когнитивной функции и препятствует атрофии при экспериментальном сотрясении мозга, аутоиммунном энцефаломиелите [3]. Ранее нами установлено позитивное влияние ЭПО на аффективный статус, психофизиологический статус, функциональное состояние вегетативной нервной системы у больных с терминальной хронической почечной недостаточности, находящихся на заместительной почечной терапии [4, 5]. Показано, что структура рецептора для ЭПО на неэритроидных клетках отличается от рецептора на клетках-предшественницах эритроцитов, а для его активации требуются наномолярные концентрации ЭПО, что снижает вероятность перекрестных эффектов ЭПО на эндокринном и паракринном уровнях. Полученные данные позволяют рассматривать локальную систему ЭПО-рецептор ЭПО как звено неспецифической защиты при повреждении, а рецепторы ЭПО на неэритроидных клетках обозначаются как защищающие ткань рецепторы. Такие рецепторы по структуре являются гетеродимером, состоящим из субъединиц рецептора ЭПО и βCR (общий рецептор β, CD131), последний также представлен в составе рецепторов для гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-3, интерлейкина-5 [6]. Такой тип рецепторов ЭПО обнаружен в ЦНС и периферической нервной системе, сетчатке и др. тканях. Установлено, что воздействие лазерного излучения (ЛИ) на ткани головного мозга активирует неоангиогенез [7]. В зонах, подвергшихся воздействию ЛИ, увеличивается экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), прежде всего, в сосудах микроциркуляторного русла, что приводит к восстановлению, перфузии тканей, в том числе после ишемии головного мозга [8]. В связи с вышесказанным, клинико-морфологическое исследование нейротропных эффектов комбинированного применения ЭПО и ЛИ представляется актуальным и перспективным в клиническом плане. Цель работы – оценить влияние комбинированного применения эритропоэтина и лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона на неврологический статус и морфологические изменения в коре головного мозга при экспериментальной ишемии головного мозга.
Материал и методы исследования. Работа выполнена на 70 беспородных половозрелых крысах обоего пола массой 220–250 г. в экспериментальной операционной с соблюдением правил асептики и антисептики, под общей анестезией препаратом «Золетил» (Virbac «Sante Animale», Фpaнция; 20 мг/кг). Животные были разделены на 3 группы: 1 группа (n=10) – контроль, у животных проводили трепанацию черепа и вскрытие твердой мозговой оболочки без диатермокоагуляции пиальных сосудов (ложнооперированные животные). Группа 2 (n=30) – модель ЭИКГМ создавали путем диатермокоагуляции пиальных сосудов коры головного мозга в сенсомоторной зоне. Группа 3 (n=30) – животные, у которых на фоне ЭИКГМ применяли ЭПО и ЛИ: через 2 часа после индукции ЭИКГМ проводили дистанционное накожное облучение области операции диодным лазером «ИРЭ-ПОЛЮС» (длина волны 970 нм, моноволоконный световод 0,6 мм, мощность 1Вт, экспозиция 2 минуты), через 3, 24 и 48 часов от индукции ИКГМ внутрибрюшинно вводили ЭПО («Эпокрин», ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, Санкт-Петербург) в разовой дозе 5000 МЕ/кг, суммарная доза 15000 МЕ/кг. Оценку неврологического статуса проводили на 1, 3, 7, 14, 30 сутки, морфологию очага повреждения – на 7, 14 и 30 сутки после индукции ЭИКГМ. Неврологический дефицит у крыс исследовали с использованием шкалы Garcia J.H. и оценкой следующих параметров: спонтанная активность в клетке за 5 мин; симметричность вытягивания передних конечностей; симметричность движений; способность забираться по стенке проволочной клетки; реакция на прикосновение к каждой стороне туловища; ответ на прикосновение к вибриссам. Максимальный неврологический дефицит – 3 балла, его полное отсутствие – 18 баллов. После выведения животных из эксперимента головной мозг фиксировали, срезы окрашивали по методам Бильшовского и Ниссля. Подсчитывали на микроскопе «Leiсa DMRXA» (Германия) с помощью компьютерной программы анализа изображений «ImageScope M» (Россия, Москва) на условной единице площади количество нейронов (неизмененных, с хроматолизом, клеток-теней). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета прикладных программ IBM SPSS Statistics 19. Данные представлены в виде медианы (Ме) и квартилей [Q1-Q3]. Значимость различий между группами оценивали при помощи критериев Крускалла – Уолиса, Манна – Уитни, Фридмана. Проверка статистических гипотез проводилась при критическом уровне значимости 0,01.
Результаты исследования. В контрольной группе ложнооперированных животных нами не отмечено значимой разницы между показателями неврологического статуса у крыс по шкале Garcia J.H. на всех сроках наблюдения (табл. 1).
Таблица 1
Влияние комбинированного применения ЭПО и ЛИ на неврологический дефицит по шкале Garcia J.H. при ЭИКГМ (баллы, Me [Q1-Q3])
Группы животных |
1 сутки |
3 сутки |
7 сутки |
14 сутки |
30 сутки |
Группа 1. Контроль |
17 [17,00-18,00] |
18 [17,00-18,00] |
18 [18,00-18,00] |
18 [18,00-18,00] |
18 [18,00-18,00] |
Группа 2. ЭИКГМ |
5 [4,00-5,25] |
6 [5,00-7,25] |
9 [8,00-10,5] |
12 [11,0-13,0] |
15 [14,0-16,25] |
Группа 3. ЭИКГМ+ ЭПО+ЛИ |
8 [6,0-9,0] |
13 [11,50-14,00] |
15 [13,75-16] |
16,5 [15,0-17,0] |
17,5 [16,75-18,0] |
Различия (критерий Фридмана) |
P<0,001 |
P<0,001 |
P<0,001 |
P<0,001 |
P<0,001 |
Различия (критерий Манна – Уитни) |
P1-2<0,001 P1-3<0,001 P2-3<0,001 |
P1-2<0,001 P1-3<0,001 P2-3<0,001 |
P1-2<0,001 P1-3<0,001 P2-3<0,001 |
P1-2<0,001 P1-3=0,05 P2-3<0,001 |
P1-2=0,003 P1-3=0,06 P2-3<0,001 |
Показатель варьировал по медиане в диапазоне 17–18 баллов. В группе животных с ЭИКГМ на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развиваются поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит в виде двигательных, чувствительных и стато-координаторных расстройств, которые медленно и не полностью регрессируют к 30 суткам эксперимента. Количественным эквивалентом изменений неврологического статуса у крыс явилось снижение показателя по шкале Garcia J.H. в 2–3 раза по сравнению с группой ложнооперированных животных, наибольшие изменения зафиксированы на 1–3 сутки, когда показатель составил 5–6 баллов, даже к 30 суткам эксперимента показатель неврологического дефицита не достигал значений в контрольной группе животных (табл. 1). При оценке морфологических изменений при экспериментальной ЭИКГМ в очаге ишемического повреждения головного мозга обнаружены изменения количественного представительства интактных нейронов, а также нейронов с признаками повреждения (табл. 2).
Таблица 2
Влияние комбинированного применения ЭПО и ЛИ на морфометрические показатели в очаге повреждения при ЭИКГМ (количество клеток / у.е. площади, Me [Q1-Q3])
Группы / Показатели |
Группа 2. ЭИКГМ |
Группа 3. ЭИКГМ + РЭП+ЛИ |
||||
7 сутки |
14 сутки |
30 сутки |
7 сутки |
14 сутки |
30 сутки |
|
Интактные нейроны |
36,50 [30,87-42,77] |
30,38 [23,08-36,39] |
25,21 [15,96-32,29] # |
92,95 [91,34-3,85] * |
95,71 [90,40-6,67] * |
99,67 [95,12-103,01] * |
Нейроны с хроматоли-зом |
25,94 [25,21-26,73] |
34,10 [32,03-35,09] # |
42,10 [40,45-43,10] # |
8,13 [7,57-8,69] * |
6,17 [6,00-7,12] * |
3,93 [3,64-4,40] * |
Клетки- тени |
62,25 [58,08-66,84] |
70,75 [67,04-72,68] # |
76,35 [70,77-78,01] # |
7,23 [6,18-7,66] * |
3,84 [3,60-4,75] * |
2,05 [1,87-2,39] * |
Примечание. * – статистические значимые (р<0,01) различия с группой 2 на соответствующие сутки, # – при сравнении с 7 сутками в группе 2.
Так, в динамике наблюдения 7–30 суток выявлено прогрессивное снижение количества интактных нейронов, статистически значимое на 30 сутки по сравнению с 7 сутками, а также увеличение количества нейронов с хроматолизом и клеток-теней на 14 и 30 сутки по сравнению с 30 сутками после ЭИКГМ.
Обнаруженные изменения неврологического статуса и морфологии очага повреждения при экспериментальной ЭИКГМ являются отражением ограничения кровотока, ишемии сенсомоторной зоне коры больших полушарий головного мозга и гипоксического некробиоза нейронов. Показательно, что формирование инфаркта происходит в течение 28–72 ч с момента развития инсульта, возможно, и дольше с учетом влияний сохраняющегося отека мозга и других отдаленных последствий ишемии.
Комбинированное применение ЭПО и ЛИ при экспериментальной ЭИКГМ приводит к существенному изменению неврологического статуса, оцениваемого по шкале Garcia J.H. (табл. 1). Так, уже через 1 сутки после индукции ЭИКГМ, применения ЛИ и однократного введения ЭПО наблюдается статистически значимое увеличение показателя неврологического статуса по сравнению с группой животных с ЭИКГМ. Такая тенденция сохраняется на 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения, причем на 14 и 30 сутки не обнаружено статистически значимых изменений показателя неврологического статуса по сравнению с контрольной группой животных, что позволяет говорить о полном восстановлении неврологического статуса после комбинированного применения ЭПО и ЛИ. При морфометрическом исследовании препаратов головного мозга животных с ЭИКГМ установлено, что, начиная с 7 суток, снижается по сравнению с контрольной группой количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней, соответственно в 3,2 раза и 8,6 раза. Количество интактных нейронов на условной единице площади возрастало на 7 сутки 2,5 раза, на 14 сутки – в 3,2 раза по сравнению с контрольной группой крыс с ЭИКГМ. На 30 сутки количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней достигало минимальных значений и снижалось в 10,7 раза и 31, 2 раза соответственно по сравнению с группой крыс с ЭИКГМ, а количество интактных нейронов примерно в 4 раза превышало значения у крыс с церебральной ишемией без лечения.
Установлено с использованием методов корреляционного анализа, что у крыс с ЭИКГМ на фоне комбинированного применения ЭПО и ЛИ на 7, 14, 30 сутки показатель неврологического статуса нарастает по мере увеличения количества интактных нейронов в очаге церебрального ишемического повреждения (соответственно R=0,62; р<0,05; R=0,71; р<0,05; R=0,85; р<0,05), снижения количества нейронов с хроматолизом (соответственно R=-0,49; р<0,05; R=-0,49; р<0,05; R=-0,68; р<0,05) и снижения количества клеток-теней (соответственно R=-0,44; р<0,05; R=-0,44; р<0,05; R=-0,65; р<0,05).
Улучшение неврологического статуса по шкале Garcia J.H. и изменение морфометрических показателей в очаге ишемического повреждения у животных с ЭИКГМ после применения ЭПО и ЛИ, возможно, связано с синергетическими эффектами ЛИ и ЭПО. Восстановление кровотока и нейропротекторные эффекты комбинированного применения ЭПО могут быть обусловлены несколькими механизмами. Во-первых, вазотропными эффектами ЭПО и улучшением кровоснабжения ишемизированной области. Установлено, что в эндотелиоцитах в условиях гипоксии комплекс рецептора ЭПО и βCR соединяется с рецептором для фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF). Такое взаимодействие необходимо для стимуляции неоангиогенеза церебральных сосудов и ЭПО-опосредованной продукции NO эндотелиоцитами [9]. Кроме этого, в отношении эндотелиоцитов ЭПО оказывает пролиферативный и хемотаксический эффекты, особенно выраженные в постишемическом периоде. Во-вторых, нейротропными эффектами ЭПО. Так, нейропротекторный эффект ЭПО реализуется за счет препятствия апоптозу нейронов в условиях гипоксии. Наряду с этим, ЭПО стимулирует функцию нейронов, улучшает их жизнеспособность через активацию Са-каналов и высвобождение нейромедиаторов, является антагонистом глутамата, регулирует продукцию нейромедиаторов, увеличивает активность антиоксидантных ферментов, тормозит NO-зависимые свободнорадикальные процессы. Кроме этого, ЭПО регулирует созревание и дифференцировку олигодендроглии и пролиферацию астроцитов, оказывает антиапоптический эффект на клетки микроглии.
Внутриклеточная трансдукция сигнала после связывания ЭПО с рецептором обеспечивается Jak-2-зависимыми сигнальными путями: трансдукторы сигналов и активаторы транскрипции (STAT-5, STAT-3), фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), протеинкиназа В (РКВ), гликоген-синтаза киназа-3β (GSK-3β), митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) и др. [10]. Так, STAT-5 приводит к активации антиапоптогенных генов и генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку клеток. PI3K, РКВ и MAPK подавляют активность GSK-3β, что приводит к стабилизации мембраны митохондрий (сохранение потенциала митохондриальной мембраны), снижению выхода цитохрома с и Apaf-1-зависимой активации каспаз. Кроме того, снижение активности GSK-3β угнетает NFκB-зависимый синтез провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИЛ6, ТНФ-α, MCP-1 и др. С другой стороны, РКВ опосредует синтез eNOS в эндотелиальных и др. клетках.
Выводы
- При экспериментальной ишемии коры головного мозга на 1, 3, 7, 14 и 30 сутки наблюдения развиваются поведенческие нарушения и очаговый неврологический дефицит, оцениваемый у крыс по шкале Garcia J.H., на 7, 14 и 30 сутки в очаге ишемии коры головного мозга прогрессивно снижается количество интактных нейронов, а также увеличивается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней.
- При комбинированном применении эритропоэтина в суммарной дозе суммарная доза 15000 МЕ/кг и лазерного излучения при экспериментальной ишемии коры головного мозга установлено улучшение неврологического статуса крыс на 1, 3, 7 сутки наблюдения и его восстановление на 14 и 30 сутки эксперимента; в очаге ишемии коры головного мозга на 7, 14 и 30 сутки прогрессивно снижается количество нейронов с хроматолизом и клеток-теней и увеличивается количество интактных нейронов.
- При экспериментальной ишемии коры головного мозга на фоне комбинированного применения эритропоэтина и лазерного излучения установлена ассоциация между показателем неврологического статуса, оцениваемого по шкале Garcia J. H., и морфометрическими показателями в очаге ишемического повреждения коры головного мозга.
Библиографическая ссылка
Осиков М.В., Гиниатуллин Р.У., Кузьмин А.Н. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА НЕВРОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И МОРФОЛОГИЮ ОЧАГА ПОВРЕЖДЕНИЯ В ДИНАМИКЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЦЕРЕБРАЛЬНОЙ ИШЕМИИ // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 5. ;URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=26782 (дата обращения: 16.02.2025).